[發明專利]一種檢測S1核酸酶及其抑制劑的熒光方法

有效

• 申請號: 201110245341.1
• 申請日: 2011-08-25
• 公開（公告）號: CN102321759A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 黃維;劉興奮;苗麗坤;范曲立;馬延文
• 申請（專利權）人: 南京郵電大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/44;G01N21/64
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 葉連生

技術領域

本發明屬于生物傳感及分析領域，特別涉及一種利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測核酸酶及其抑制劑的熒光檢測方法。

背景技術

核酸酶是指作用于核酸的磷酸二酯鍵的酶。依據底物不同分類，可分為DNA酶和RNA酶；依據切割部位不同，又可分為核酸內切酶、限制性內切酶和核酸外切酶。生物體內的核酸酶負責細胞內外催化核酸的降解，對生命過程起著非常重要的作用。核酸酶的用途包括參與DNA的合成與修復及RNA轉錄后的剪切、修飾和降解等重要基因復制和基因表達過程；負責清除多余的、結構和功能異常的核酸，同時也可以清除侵入細胞的外源性核酸；在消化液中降解食物中的核酸以利吸收；是體外重組DNA技術中的重要工具酶。

由于核酸酶生理功能的重要意義，近年來受到科學家們越來越多的關注，因此迫切需要尋找快速、簡便、高靈敏度的方法來檢測核酸酶。隨之，對核酸酶的檢測材料和方法的開發研究成為一個熱點。目前針對于核酸酶檢測的新型分析方法已經在生命科學研究和疾病分子診斷等領域得到迅速發展。對核酸酶研究的不斷深入，必將對生命本質的探索和人類的未來作出更大的貢獻。

近年來氧化石墨烯以其特殊的力學、量子學和電學性質，頗受物理和材料學界重視。由于其具有優異的電學性能、導熱性好、水溶性好、比表面積大等優點，也為生物分子的檢測提供了新的思路。目前隨著單壁碳納米管在生物傳感中的成功應用，氧化石墨烯也逐漸成為傳感領域青睞的對象。由于氧化石墨烯的特殊性質，使得檢測過程操作簡單、反應快速，這樣大大減少了實驗的步驟，同時可以顯著的提高檢測的靈敏度和特異性。

發明內容

技術問題：本發明要解決的技術問題是針對現有的核酸酶檢測方法存在的不足，提供一種利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測S1核酸酶及其抑制劑的熒光方法，其具有較高的特異性和靈敏度。

技術方案：本發明檢測S1核酸酶及其抑制劑的熒光方法，其特征在于該方法包括以下步驟：

a.將染料標記的寡核苷酸熒光探針加入到緩沖溶液中，以480nm為激發波長，進行熒光檢測，記錄該探針的熒光發射譜帶；

b.將氧化石墨烯加入到上述溶液中，氧化石墨烯作為固相載體吸附自由卷曲狀態的寡核苷酸探針，形成寡核苷酸/氧化石墨烯復合物，此時染料的熒光被氧化石墨烯猝滅；

c.經S1核酸酶切割的寡核苷酸互補鏈，加入到寡核苷酸/石墨烯復合物中進行反應；

d.寡核苷酸互補鏈經過S1核酸酶的特異性降解作用形成小的堿基片段，無法與氧化石墨烯表面的寡核苷酸鏈探針形成雙螺旋結構，從而寡核苷酸探針不能脫離氧化石墨烯的表面，染料的熒光信號不能恢復；根據熒光信號恢復的程度實現對S1核酸酶的定性及定量檢測；

e.寡核苷酸互補鏈在抑制劑腺苷三磷酸存在下經S1核酸酶降解作用，加入寡核苷酸/氧化石墨烯復合物中進行反應；

f.寡核苷酸互補鏈在抑制劑腺苷三磷酸存在下不會被S1核酸酶降解，與寡核苷酸探針形成雙螺旋結構，寡核苷酸探針脫離氧化石墨烯的表面，染料的熒光信號得以恢復；根據熒光信號恢復的程度實現對抑制劑腺苷三磷酸的定性及定量檢測。

其中：

步驟a)所述的將染料標記的寡核苷酸熒光探針加入到緩沖溶液中，用熒光分光光度計進行檢測，所用染料為熒光素；染料標記在寡核苷酸探針的5’端；寡核苷酸探針堿基組成為：5’-FAM-ATCTTGACTATGTGGGTGCT-3’；所用緩沖溶液為20mM?Tris-HCl，100mM?NaCl，5mM?KCl，5mM?MgCl₂，pH＝7.4；所用熒光檢測方法為：將探針溶液加入到1.6mL緩沖溶液中進行熒光發射光譜的掃描，激發波長為480nm，發射波長掃描范圍為490-650nm。

步驟b)所述的寡核苷酸/氧化石墨烯復合物的形成，是通過非共價鍵相互作用使寡核苷酸探針吸附到氧化石墨烯表面；寡核苷酸吸附到氧化石墨烯表面后，染料的熒光被氧化石墨烯猝滅，將氧化石墨烯加入到含有寡核苷酸探針的緩沖溶液中后，室溫放置5分鐘，然后進行熒光檢測，激發波長為480nm，掃描范圍為490-650nm。

步驟c)經S1核酸酶切割的寡核苷酸互補鏈，加入到寡核苷酸/石墨烯復合物中進行反應，所用的寡核苷酸互補鏈探針堿基組成為：5’-AGCACCCACATAGTCAAGAT-3’；加入含有S?1酶的寡核苷酸互補鏈溶液或其它等體積的對照溶液后熒光信號恢復所用的時間為室溫，25分鐘左右。