[發明專利]一種適用于轉人抗凝血酶Ⅲ基因山羊的快速簡便檢測方法

有效

• 申請號: 201110244574.X
• 申請日: 2011-08-25
• 公開（公告）號: CN102952853A
• 公開（公告）日: 2013-03-06
• 發明（設計）人: 劉榜;翟珊莉;陶晨雨;張慶德
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術領域

本發明屬于轉基因成分的檢測技術領域，具體涉及一種適用于轉人抗凝血酶III基因山羊的轉基因成分的快速簡便檢測方法。?

背景技術

轉基因生物的安全評價是轉基因生物及其產品市場化和商品化的前提，在安全評價中轉基因成分的檢測是一項重要內容，建立轉基因生物快速、簡便、準確的檢測方法為安全評價和管理奠定基礎。人抗凝血酶(hAT)，也有人稱為人抗凝血酶III(hATIII)，是肝臟產生的凝血系統中最重要的抗凝因子。在正常生理狀態下，它可以阻止凝血的發生，維持血液的正常流動；當血管受損時，又能限制血凝塊的擴大，防止血液堵塞。(楊海.人抗凝血酶III的cDNA克隆、表達、純化及其重組蛋白對DIC大鼠模型的療效研究.[博士學位論文].陜西楊凌：西北科技農林大學，2009.)2009年7月，青島森淼生物技術有限公司與青島森淼生物技術研究所所承擔的國家863計劃所生產的利用乳腺生物反應器生產的抗凝血酶III蛋白純品研究成果通過國家級項目評估，標志著我國血液蛋白抗凝血酶III的生產將擺脫對血源的依賴(傳統方式是從人體血液中提取)。鑒于轉人抗凝血酶III基因山羊生產技術的成熟以及其產品市場化的趨勢，因此建立一種快速、簡便的檢測人抗凝血酶III基因的方法，具有必要性和緊迫性。?

綜合目前各國對轉基因產品的檢測技術，根據檢測目標，可將其分為以下三個水平：插入的外源基因的檢測；插入外源基因的表達產物(RNA或者蛋白質)的檢測；插入的外源基因對受體生物基因表達的影響(外源基因的插入對位點附近的基因的影響從而對整個生物體的代謝的影響)的研究，而其中核酸水平的檢測應用更為廣泛。核酸水平的檢測，主要采用的方法是PCR擴增，即依據轉入外源基因的啟動子、目的基因、終止子及表達(重組)載體信息，設計特異性引物，進行聚合酶鏈式反應，依據產物的有無或多少判斷是否為轉基因產品。PCR檢測轉基因產品，通常涉及以下技術：定性PCR、定量PCR、巢式PCR、多重PCR、熱不對稱交錯PCR等。?

PCR反應具有高靈敏度、高特異性、高效性的特點，是轉基因產品初篩階段的主要檢測方法，需要進行PCR擴增和電泳檢測兩個環節，但必須依賴PCR儀等精密儀器，檢測費用高，對檢測人員有較高的技術要求，無法在條件較差的基層實驗室進行。?

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的局限性，提供適用于轉人抗凝血酶III基因山羊的快速簡便檢測方法，利用環介導等溫擴增法原理建立外源基因的快速檢測方法，能準確快速檢測出轉基因山羊中人抗凝血酶III基因。本發明不需要特殊設備，為基層檢測人員提供一種快速簡便的方法，本發明的方法同時也為轉基因生物及其產品安全評價和管理提供借鑒。?

實現本發明的技術方案如下：?

(1)引物設計及合成：根據人抗凝血酶III基因(hATIII)的基因(GenBank：X68793)序列設計特異性引物，所述引物的DNA序列如下所示：?

FIP：5′-GCATGTGGACCACCACGATCA-CCAGAGGTGCTGCAAGAG-3′；?

BIP：5′-CGCTTCCGCATTGAGGACGG-TCGACAAGGCCCATGTCTT-3′；?

F3：5′-GGCCAAGGTAGAGAAGGAAC-3′；?

B3：5′-GGACTTTTCAGGGCTGAACA-3′；?

(2)環介導等溫擴增反應?

以FIP、BIP為內引物，F3、B3為外引物對人抗凝血酶III基因進行恒溫擴增，其反應體系為：1M甜菜堿，400μM?dNTPs，2.5μl?10×Bst?Buffer，Mg²⁺?3mM，4.8U?Bst?DNA聚合酶，1μl模板，外引物F3和B3各0.24μM，內引物FIP和BIP各1.56μM，補雙蒸水至25μl，將上述除酶以外的所有試劑混勻置于200μl?EP管中，于90℃反應5min，反應后立即冰浴1-2min，再加入4.8U?Bst?DNA聚合酶，于59℃反應60min，80℃下反應5min后終止反應；?

(3)環介導恒溫擴增產物分析?

1)瓊脂糖凝膠電泳：取2.5μl擴增產物，加入1μl上樣緩沖液(濃度為40％的甘油，0.2％溴酚藍，59.8％0.25M?Tris-HCl)，混勻，再于2％瓊脂糖凝膠中電泳30min，得到凝膠成像，觀察是否有階梯型條帶，若有階梯型條帶則判定為含有人抗凝血酶III基因(即含有轉基因成分)，若沒有階梯型條帶則判定為不含人抗凝血酶III基因。?