[發明專利]培養基、細胞培養用試劑盒及細胞培養方法

有效

• 申請號: 201110243657.7
• 申請日: 2011-05-17
• 公開（公告）號: CN102787093B
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發明（設計）人: 李暉
• 申請（專利權）人: 李暉
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 北京市嘉元知識產權代理事務所(特殊普通合伙)11484
• 代理人: 劉彬

本申請是申請號為201110127667.4，發明名稱為培養基、細胞培養用試劑盒及細胞培養方法的中國發明專利申請(申請日為2011年5月17日)的分案申請。

技術領域

本發明涉及培養基、細胞培養用試劑盒及細胞培養方法，特別是用于上皮細胞培養的培養基、細胞培養用試劑盒及細胞培養方法。

背景技術

人體重要器官如肺、腎、肝、胰腺和皮膚都由器官特異性分化的上皮細胞為其組成成分。這些特異性分化的上皮細胞與不同器官的特異性功能直接相關，如肺的氣體交換功能、腎的過濾功能、肝的解毒及中和功能、胰腺細胞產生胰島素、皮膚具有保護機體免受外界環境的傷害。而這些重要器官一旦發生病變或退化就會威脅人類的健康，因為這些重要器官是很難被替換的，不同器官的特異性細胞也不能相互取代其它器官的細胞。

特異性分化的細胞，如腎上皮細胞、胰腺的胰島素產生細胞、真皮的毛囊和腺體細胞都是很難再生的，更不要說在體外進行培養增殖了。實驗動物(包括各種轉基因和克隆動物)是用于疾病發病機理研究和新藥研發的必要工具。但是，對于分離自人和哺乳動物的原代上皮細胞的體外培養仍然是很困難的。應用目前的無血清培養基，有的只能進行短期的原代培養(存活數天，如肺和胰腺等上皮細胞)，有的只能進行有限的傳代培養(1-3代，如氣管/支氣管及前列腺等上皮細胞)，有的甚至根本不能體外培養(如肝和結腸等上皮細胞)，只有來自于人體皮膚的角化上皮細胞可以傳代培養10代左右。而且從每個動物或活體組織樣品中獲得的上皮細胞產量仍然很低，包括細胞的數量、直接分離或短期培養的細胞純度都是很低的，這些原代和傳代上皮細胞的增殖速度也極為有限。

為了在體外進行上皮細胞的培養，目前國外嘗試通過遺傳操作，如轉入病毒(SV40T或HPV16E6E7)或細胞癌基因，可以延長體外細胞存活的代數。然而遺傳操作的最大缺點是會改變這些細胞的遺傳背景和表型，以致讓這些正常上皮細胞丟失其正常生理功能，如p53和pRB信號通路常常被抑制。而且，這些經遺傳修飾的細胞是不可能重新再移植進機體的。但是由于目前缺乏有效的體外培養上皮細胞的技術，上述這些細胞在當今世界的醫學和生命科學研究中仍然備受青睞。在非癌癥研究領域，它們就代表著最初來源的“功能”性的組織或器官。在癌癥研究領域，它們還常常被用來作為“正常細胞”對照。而且它們的市場價格還非常昂貴。

抗腫瘤藥物研究的第一步就是藥物對癌細胞的特異性毒性實驗，目前所用的癌細胞株(如HeLa和A539等)多在體外傳代數年甚至數十年，它們在很大程度上已不能反應同類型人體惡性腫瘤的特性，一些實驗室還存在大量癌細胞株的交叉污染。而且對于不同的個體，即使同一類型的腫瘤也可能由不同的原因或機制所導致，因此對于每一種腫瘤，都需要有能代表其特定發病機制的細胞株來進行新藥研發。更為突出的例子，如前列腺癌的研究領域根本沒有人類原發前列腺癌的細胞系，僅有的細胞系(LnCAP，PC-3，DU-145)都是來自轉移后的腫瘤組織。盡管如此，全世界90％以上的腫瘤研究和幾乎所有抗癌新藥的研究還在繼續使用著可能根本沒有代表性的癌細胞株。因此，目前癌癥研究和新藥研發要解決的關鍵問題是，如何能獲得反應各種類型人體腫瘤特性、同種腫瘤代表不同個體特性或不同發病機制的癌細胞。當然，歸根結底的真正難題是缺乏有效的上皮細胞的原代和傳代培養技術。另外，抗腫瘤藥物存在的很多毒副作用，很大程度上是因為新藥研究缺乏正常的細胞對照。若能得到來自于同一個體同一組織的癌細胞和正常細胞(美國Asterand公司用上述HPVE6E7轉化得到的所謂的“正常”和癌的前列腺細胞，價格雖然高達1,2000美金/對，但還是十分搶手)，新藥研發的第一步將會回歸科學，抗癌新藥研究的歷史必將重寫。

再生醫學是現代臨床醫學的一種嶄新的治療模式，即以再生、再造、代替和新生為基本治療原理的現代干細胞移植治療術，利用干細胞(胚胎干細胞和成體干細胞)具有向各種細胞分化轉變能力，治療臨床上眾多的、目前尚無治療辦法的變性、壞死性和損傷性疾病，具有顯著和獨特的醫療效果。然而目前面臨的困境是，雖然胚胎干細胞具有分化能力，再生性和可塑性強，但可能致瘤和面臨倫理爭議，如何誘導其定向分化和增加移植的成活率仍然是未解的難題；而成體干細胞來源稀少，難以識別、分離及純化，因此阻礙了其臨床應用；目前新興的研究熱點——誘導性多能干細胞，由于其涉及遺傳操作導致細胞遺傳背景的改變，且導入的外源基因和病毒基因有致癌或致畸的潛能而不能用于臨床治療。