[發明專利]家蠶蛹期特異的BmCP283基因啟動子及其制備方法與運用

有效

• 申請號: 201110242881.4
• 申請日: 2011-08-23
• 公開（公告）號: CN102286487A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 程道軍;夏慶友;唐林;徐漢福;馬三垣;向仲懷
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及生物基因技術領域，特別涉及家蠶BmCP283基因啟動子及其運用。

背景技術

家蠶屬于全變態昆蟲，一生經歷卵、幼蟲、蛹和成蟲4個形態特征和生理功能顯著不同的發育階段。從幼蟲吐絲完畢至成蟲羽化的階段被稱為變態期，包含幼蟲-蛹和蛹-蛾的變態。作為重要的經濟昆蟲，家蠶在生產上主要用于結繭繅絲。家蠶在幼蟲末期熟蠶時開始上蔟吐絲，經過3日左右吐絲終了，再經過1～2日蛻皮化蛹，經兩周左右羽化成蛾，交配產卵。生產上必須在幼蟲化蛹后且化蛾前完成鮮繭的收購，然后利用熱能或其他方法烘死蠶蛹和寄生蠅蛆，防止出蛾、出蛆、霉變，并除去蛹體及繭層的自由水分以達到長期安全貯藏的目的。由于時間緊迫，而且要保證蠶繭收購、運輸和烘干的順利進行，給生產造成了一定難度。又由于繭絲成分主要是蛋白質，高溫烘烤使蠶絲品質受到破壞，影響后加工。因此，如果能通過遺傳改良等方法使蛹期發育延長或停滯，這將有助于解決鮮繭收烘與蛹發育過短之間的矛盾，改革蠶繭收購-烘干-繅絲的傳統生產模式，促使生絲加工工藝的重大改革并顯著提高生絲品質。

在遺傳上實現家蠶蛹期發育調控主要涉及兩個關鍵問題，一是有用于使蛹期發育延長或停滯的靶基因，該基因的轉錄沉默或超量表達能對蛹期發育進行有效的控制；二是使候選靶基因在蛹期（化蛾前）特異表達，如果在胚胎、幼蟲或成蟲等其他發育階段發揮作用，勢必達不到預期效果，甚至會影響正常的蠶繭產量。因此，蛹期特異的啟動子是實現該目標的重要保證，但至今相關研究較少。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種基因啟動子，該啟動子為家蠶蛹期特異性啟動子。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：

家蠶BmCP283基因啟動子，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

家蠶BmCP283基因啟動子的截短片段，所述截短片段為如SEQ?ID?NO:7、SEQ?ID?NO:8、SEQ?ID?NO:9或SEQ?ID?NO:10所示的核苷酸序列。

本發明的目的之二在于提供一種啟動子得制備方法，該方法操作簡單，適用于普通實驗室使用。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：

所述的家蠶BmCP283基因啟動子的制備方法，具體步驟為：以家蠶基因組為模板進行PCR擴增，其中上游引物如SEQ?ID?NO:2所示，下游引物如SEQ?ID?NO:3所示；

擴增條件為：94℃預變性4分鐘，94℃變性30秒，59.9℃退火30秒，72?℃延伸90秒，共30個循環；最后72?℃延伸10?分鐘，得如SEQ?ID?NO:1所示的家蠶BmCP283基因啟動子。

本發明的目的之三在于提供一種重組表達載體，其能對蛹期發育進行有效的控制。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：

所述的家蠶BmCP283基因啟動子的重組載體。

進一步，所述重組載體為BmCP283-DsRed-SV40片段同基礎載體pBac[3xP3-EGFPafm]連接而成的pBac[BmCP283-DsRed-SV40,?3xP3EGFP]?的重組載體；

本發明的目的之四在于提供一種所述重組載體的制備方法，該方法適用于普通實驗室。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：

所述的重組載體的制備方法，將經酶切的如SEQ?ID?NO:1所示的家蠶BmCP283基因啟動子與經同樣酶切的含有具備表達外源蛋白的基因的載體片段連接，得顯微注射載體。

進一步，酶切所述顯微注射載體后與經同樣酶切的含有熒光蛋白標簽的基礎載體連接，得含有熒光蛋白標簽的顯微注射載體；

進一步，將如SEQ?ID?NO:1所示的家蠶BmCP283基因啟動子與載體pMD19-T?simple進行TA克隆后得到的重組載體，分別用SalⅠ和BamHⅠ雙酶切pMD19-?BmCP283質粒，回收家蠶BmCP283基因啟動子與分別用SalⅠ和BamHⅠ雙酶切的pSL[ser1-DsRed-SV40]載體片段進行連接，構建成pSL[BmCP283-DsRed-SV40]；

進一步，用AscⅠ酶切步驟B所得pSL[BmCP283-DsRed-SV40]，將酶切所獲得的BmBmCP283-DsRed-SV40片段連接到AscⅠ酶切的pBac[3xP3-EGFPafm]基礎載體，構建成pBac[BmCP283-DsRed-SV40,3xP3EGFP]顯微注射載體。