[發明專利]用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的引物、試劑盒和方法

有效

• 申請號: 201110242721.X
• 申請日: 2011-08-23
• 公開（公告）號: CN102952851A
• 公開（公告）日: 2013-03-06
• 發明（設計）人: 吳亞君;陳穎;王斌;韓建勛;袁飛
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 隆天國際知識產權代理有限公司 72003
• 代理人: 吳小瑛;菅興成

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體而言，本發明涉及用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的引物、用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的試劑盒、使用所述引物或試劑盒檢測啤酒大麥品種和/或純度的方法，以及所述引物或試劑盒在檢測啤酒大麥品種和/或純度中的應用。

背景技術

大麥是僅次于水稻、小麥、玉米等糧食作物的第四大主產作物，根據其用途可分為啤酒大麥、飼用大麥、食用大麥三種類型。其中啤酒大麥是啤酒釀造的主要來源。目前我國啤酒大麥種植面積約1000萬畝，年產約150-200萬噸，優質啤酒大麥產量遠遠達不到市場需求，據統計1998-2007年我國從澳大利亞、加拿大、法國共計進口1834.1萬噸啤酒大麥，年均進口量183萬噸。近年來，由于啤酒工業的迅猛發展，對啤酒大麥的需求不斷增大，同時對其品質要求也隨之提高。啤酒大麥種質的優劣將直接影響麥芽和啤酒品質。因各地風土氣候和耕種習慣等原因，世界各地不同品系、不同產地的啤酒大麥各不相同，釀造出的啤酒質量也大相徑庭。

啤酒大麥品種和/或純度是評判啤酒大麥質量的重要指標，準確鑒別啤酒大麥品種和/或純度是啤酒大麥原料質量控制的重要措施。目前，由于生產、經營、管理不規范，不合格種子甚至假種頻繁混入市場，對啤酒工業造成了一定損失，并損害了品種權擁有者的利益和廣大農民的經濟利益，破壞了良好的市場秩序。因此，建立一套完善的種質鑒定體系尤為重要。目前，傳統的鑒定手段多采用形態標記方法，如穗長、粒色、干粒重等，但該法易受環境及雜交過程個體變化影響，鑒定結果不可靠。

在啤酒大麥種質鑒定方面尋求可靠的分子生物學技術成為一種趨勢。RAPD(隨機擴增多態DNA)技術作為一種DNA分子指紋技術，是利用合成的隨機引物基于整個基因組序列進行隨機PCR擴增，不同的基因組由于序列的差異導致PCR產物長度多態性，通過電泳檢測到的多態性特征對不同基因組進行區分，十分容易發現不同樣品之間的序列差異。因此，RAPD在物種鑒定中的優勢非常突出，不僅操作相對簡便，容易標準化，而且是從基因水平進行分析，不受外界條件的影響，分辨率高，可有效區分近緣品種。目前，國內外對于檢測啤酒大麥的品種和/或純度的RAPD方法研究較少，而且技術尚不夠成熟，尤其是對于啤酒大麥的純度檢測尚無直接根據擴增條帶進行半定量的先例。另外，傳統的啤酒大麥RAPD檢測技術是通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳進行PCR產物的檢測，例如“侯永翠等，利用RAPD標記分析大麥種質資源的遺傳多樣性，《植物遺傳資源學報》2005，6(2)：145～150”和“張大樂等，中國啤酒大麥品種RAPD標記的遺傳多樣性分析，《武漢植物學研究》2005，23(4)：305～309”中所揭示的，通過肉眼觀察分子量標準對應位置來判斷標記條帶的有無，容易受到電泳條件變化或操作誤差造成的條帶位置偏差的干擾，加上隨機擴增自身的非特異性，得到的圖譜往往在重現性上存在問題。另外，目前針對啤酒大麥之類的谷物純度的基因鑒別方法主要采用單粒法，操作繁瑣，需要投入大量人力物力。

因此，本領域需要一種快速、簡便以及可靠的啤酒大麥品種和/或純度的檢測方法。

發明內容

一方面，本發明提供了用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的引物，所述引物的核苷酸序列為SEQ?ID?No.1-5所示。

本發明所述引物的核苷酸序列分別為：

SEQ?ID?No.1(Opp14)：5’CCAGCCGAAC3’；

SEQ?ID?No.2(BA8)：5’GTCCACACGG3’；

SEQ?ID?No.3(BA10)：5’CTGCTGGGAC3’；

SEQ?ID?No.4(BA152)：5’TTATCGCCCC3’；以及

SEQ?ID?No.5(BA187)：5’TCCGATGCTG3’。

另一方面，本發明提供了用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的RAPD試劑盒，所述試劑盒包含本發明所述的引物。

根據一種優選的實施方式，本發明的所述試劑盒還包含使用說明書，所述使用說明書中記載的隨機PCR擴增反應條件是：94℃，10min；94℃1min，37℃1min，72℃2min，45個循環；72℃5min。

根據一種優選的實施方式，本發明的所述試劑盒還包含用于提取樣品DNA的試劑和用于隨機PCR擴增反應的試劑。

根據一種進一步優選的實施方式，所述試劑盒還包含標準品和陰性對照，所述標準品為啤酒大麥目標品系的DNA序列，所述陰性對照為無菌雙蒸水。