[發(fā)明專利]KIT信號相關基因QPCR芯片

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110242503.6
• 申請日: 2011-08-23
• 公開（公告）號: CN102296115A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發(fā)明（設計）人: 吳寶金
• 申請（專利權）人: 杭州師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B40/06
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 王江成;朱實

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種用于KIT信號相關基因檢測的QPCR芯片。

背景技術

人KIT原癌基因起源于HZ4貓肉瘤病毒，位于人染色體4q12，在4號染色體長臂中心體周圍區(qū)域，是白色斑點顯性基因的等位基因。在小鼠中該基因位于第5號染色體距著絲粒約42cM處。人類KIT基因組DNA全長大約89kb，包括21個外顯子。KIT基因編碼的蛋白質(zhì)被稱為KIT或c-kit受體，是一個分子量為145kD的I型跨膜性糖蛋白，屬于III型蛋白酪氨酸激酶受體超家族成員，分布于細胞膜表面。其結(jié)構類似于巨噬細胞集落刺激因子和血小板源生長因子受體，由胞外結(jié)構域、單一跨膜區(qū)及胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域三部分組成。胞外區(qū)包含5個免疫球蛋白樣結(jié)構域，開始的3個是SCF(干細胞因子)結(jié)合區(qū)，第4、5個結(jié)構域在穩(wěn)定SCF及誘導KIT受體二聚化方面起重要作用。Broudy等研究發(fā)現(xiàn)第5個結(jié)構域還與KIT受體從細胞膜上的溶蛋白性裂解有關。胞內(nèi)部分則包含了由ATP結(jié)合區(qū)和磷酸轉(zhuǎn)移酶區(qū)組成的具有酪氨酸激酶活性的結(jié)構域。其配體為肥大細胞生長因子、干細胞生長因子、steel因子等，以分泌型和膜結(jié)合型兩種方式與KIT受體結(jié)合。分泌型可使KIT受體激活、內(nèi)化、降解；膜結(jié)合型則能維持KIT受體較長的激活狀態(tài)。KIT受體與配體特異性結(jié)合可觸發(fā)其同源二聚化和細胞膜內(nèi)酪氨酸殘基的磷酸化，產(chǎn)生停泊位點，捕獲含SH2結(jié)構域的信號分子，還能直接激活蛋白激酶C、MAP激酶、Racl、JNK、Raf-1、JAK2等，通過多種信號因子的參與將細胞外的信號轉(zhuǎn)導到細胞內(nèi)部，引發(fā)某些基因的特異性表達。SCF/KIT共同參與多種細胞信號的轉(zhuǎn)導，如：Jak/STAT信號途徑、PI3K途徑、Src家族激酶途徑、Ras/Raf/MEK/ERK信號途徑等，是各種底物激酶的酪氨酸磷酸化和絲/蘇氨酸激酶磷酸化的整合步驟，并且存在著多種信號轉(zhuǎn)導途徑之間的交互作用(cross-talking)，從而精確地調(diào)控細胞的增殖和分化。Kit基因突變不僅僅影響黑素細胞的遷徙與分化而導致斑駁病的產(chǎn)生，也會影響原始生殖細胞的發(fā)育而導致不孕不育，以及影響造血細胞生成而導致貧血及肥大細胞缺乏等，嚴重的Kit基因突變還會導致純合致死，同時，Kit基因是一個重要的原癌基因，Kit基因高表達會導致粒細胞白血病、精原細胞瘤及消化系統(tǒng)間質(zhì)腫瘤。SCF/KIT共同參與的多種細胞信號轉(zhuǎn)導與上述病變密切相關，這些疾病病理發(fā)育過程中相關信號過程的變化是近年來kit信號轉(zhuǎn)導研究中的熱點問題。

QPCR(Real-Time?Quantitative?PCR)在基因表達水平、病原體及產(chǎn)前診斷等方面得到廣泛運用。其原理是在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，常用的兩種方法為SYBR?Green(熒光染料摻入法)和Taqman?probe(探針法)。SYBR?Green熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號。熒光染料的優(yōu)勢在于它能監(jiān)測任何dsDNA序列的擴增，不需要探針的設計，使檢測方法變得簡便，同時也降低了檢測的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，因此它也能與非特異的dsDNA(如引物二聚體)結(jié)合，使實驗容易產(chǎn)生假陽性信號。引物二聚體的問題目前可以用帶有熔解曲線(melting?curve)分析的軟件加以解決。相關論文最早發(fā)表于1996年，隨后在實驗方法、儀器設備上進行了一系列改善，已經(jīng)在科研和臨床診斷領域得到了越來越廣泛的應用。近年來，對于熒光定量PCR的要求越來越規(guī)范化。從RNA的提取→RNA完整性和純度的鑒定→逆轉(zhuǎn)錄→反應體系的優(yōu)化→最后的數(shù)據(jù)分析都有一套嚴格的標準，從而增加了熒光定量PCR結(jié)果的可靠程度，也使實驗的可重復性得到提高。QPCR芯片是在儀器設備更新的基礎上發(fā)展起來的，將近百個或數(shù)百個QPCR反應設計在一塊板子上同時進行擴增，以檢測相關基因的表達豐度。

基因芯片是“高通量”現(xiàn)代生物技術的標志，其原理是基于核酸分子雜交，用熒光染料標記樣本DNA或cDNA，與基因芯片雜交，經(jīng)激光共聚焦熒光顯微鏡檢出雜交信號，通過計算機處理、分析，得到所需信息。突出特點在于高通量、微型化和自動化。但它存在三個方面的缺點：1、費用高；2、難以檢測低豐度表達的基因；3、偏重高通量(一次檢測上萬個甚至幾萬個基因)，缺少針對如皮膚、海馬組織或某種腫瘤等特定組織類型的表達“芯片”。