[發明專利]一種T載體及其構建方法與其前T載體

無效

• 申請號: 201110242359.6
• 申請日: 2011-08-22
• 公開（公告）號: CN102311968A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發明（設計）人: 李威
• 申請（專利權）人: 生工生物工程（上海）有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 上海脫穎律師事務所 31259
• 代理人: 李強

技術領域

本發明屬于分子生物學及生物工程技術領域，涉及一種基因工程操作中的DNA片段克隆方法。具體地，本發明涉及一種T載體及其構建方法與其前T載體。

背景技術

DNA的重組技術，也就是基因克隆技術，是現代分子生物學發展中最重要的成就之一，也是基因工程的核心技術。廣義來說，DNA的重組技術是指利用供體生物的遺傳物質，或人工合成的DNA分子，經過體外的分離純化、PCR擴增、限制酶切割等處理后與適當的載體連接起來形成新的重組DNA分子，然后將重組DNA分子導入受體生物中，從而實現對目標DNA分子的保存、擴增和分析等操作。

可以作為DNA載體的有質粒、粘粒、噬菌體、人工染色體等，其中質粒載體是應用最為廣泛的分子克隆載體。一個完整的基因工程質粒載體包括復制子(用于控制質粒分子在宿主體內的復制與擴增)、篩選基因(如抗性基因、報告基因，或兩者都有，用于確認、跟蹤或分離帶目標質粒的宿主)、多克隆位點(便于DNA分子的切割與連接)以及用于控制質粒行為(如拷貝數)或用于分析的一些特別的DNA序列(如用于質粒測序的一些引物互補序列等)。

DNA分子的切割與連接可以通過限制性內切酶和連接酶來完成，即分別用相應的限制性內切酶切割目標DNA分子和載體DNA分子，使其兩端分別獲得含有部分單鏈突出的末端(粘性末端)，含有互補序列的末端(由同一個酶或同尾酶切割獲得)在DNA連接酶的作用下形成一條完整的DNA鏈。

PCR技術的產生與發展使得利用PCR技術獲得待克隆的DNA分子成為一種方便而高效的手段，但對于利用PCR方法獲得的片段而言，采用限制酶切割的方法獲得與載體匹配的末端有諸多不便：首先，需要在PCR產物兩端引入相應的酶切位點，增加了引物的成本；其次，當限制性內切酶識別位點位于DNA片段的末端時，其切割效率受影響；再次，用限制性內切酶處理后，正確切割或未切割的DNA分子難以分離，這將影響后續DNA片段與載體的連接效率。因此，一種針對PCR片段的克隆技術——TA克隆——得到發展并被廣泛使用。

TA克隆技術是指把PCR片段與一個具有單個3’-dT突出的載體DNA分子連接起來的方法。其原理在于，在PCR反應中所使用的如Taq等DNA聚合酶具有末端轉移的活性，該活性使得其能在PCR擴增得到的DNA分子末端的3’端添加一個突出的dA，從而可以與具有3’-dT突出的載體DNA分子互補連接。與限制性內切酶切割后連接的方法相比，TA克隆使得通過PCR獲得的DNA片段可以直接克隆到載體中，大大簡化了克隆過程，提高了效率。經過特別設計和加工制備的兩端具有3’-dT突出的線性DNA載體則稱為T載體。

T載體是TA克隆技術的核心，目前常用的T載體制備方法有兩種：一種是平末端添T法，即在環狀的質粒載體(T載體前體)預設位置處用合適的限制性內切酶(如EcoR?V，Sma?I等)切割，形成兩端為平末端的線性DNA分子，隨后用帶有末端轉移酶活性的酶在合適的條件下在線性DNA分子的兩端添加一個3’-dT，經過進一步純化，獲得制備好的T載體；

另一種制備T載體的方法是酶切法，該方法利用某些限制性內切酶(如Xcm?I，Eam1?105?I等)切割后在3’留下單個核苷酸的特性，經過精心設計，使得該位置的核苷酸為T，因此，在載體上設計兩個串聯的該酶的識別位點，則切割后在載體的兩端分別獲得一個突出的3’-dT，回收該線性DNA分子即為T載體。

發明內容

本發明的目的在于提供一種T載體及其構建方法與其前T載體。

本發明首先公開了一種T載體，為兩個末端均帶有3’-dT突出的線性載體，所述兩個3’-dT突出末端的旁側序列滿足當經所述T載體與兩端帶3’-dA的PCR產物相連后，在插入片段兩端能形成兩個限制性內切酶酶切位點；所述兩個限制性內切酶酶切位點為同一種限制性內切酶的酶切位點。

所述限制性內切酶酶切位點可以是，但不局限于Hind?III酶切位點。

所述T載體中還應當帶有其他T載體常用的必須元件。

所述T載體常用的必須元件包括：復制子、抗性基因(如氨芐青霉素基因表達盒)和篩選標記(如lacZ’標記基因等)。T載體中還可選擇性地包括下列元件：用于控制質粒行為(如拷貝數)或用于分析的一些特別的DNA序列等。

較佳的，所述T載體與兩端帶3’-dA的PCR產物相連后，除PCR產物自帶的限制性內切酶酶切位點外，僅含有兩個限制性內切酶識別位點。T載體中沒有其他常用的限制性內切酶識別位點，可以用通用引物進行DNA序列測定。