[發(fā)明專利]大鯢虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110241848.X
• 申請(qǐng)日: 2011-08-23
• 公開（公告）號(hào): CN102286642A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周勇;曾令兵;張輝;孟燕;范玉頂;肖藝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于大鯢病害檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種大鯢虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，該P(yáng)CR試劑盒不僅可使用目前存在市場(chǎng)上的所有類型熒光定量PCR儀器，更重要的是能快速地對(duì)大鯢虹彩病毒進(jìn)行定量檢測(cè)。同時(shí)還涉及一種大鯢虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒的用途。

技術(shù)背景

大鯢(Andrias?davidiamus)俗稱娃娃魚，是國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，并且被列入CITES公約(瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約)種類目錄中，是現(xiàn)存?zhèn)€體最大的兩棲類動(dòng)物，有很重要的科研價(jià)值及藥用和營養(yǎng)價(jià)值。但是，由于人為捕獵和自然環(huán)境的改變，野生大鯢數(shù)量急劇下降(Wang?X?M，Zhang?K?J，Wang?Z?H，et?al.The?decline?of?the?Chinese?giant?salamander?Andrias?davidianus?and?implications?for?its?conservation[J].Cambridge?Journal，2004，38：197-202.)基于保護(hù)和開發(fā)利用的目的，目前興起了大鯢的人工養(yǎng)殖。人工養(yǎng)殖很難完全模仿自然狀態(tài)下大鯢的生活環(huán)境，加之對(duì)大鯢的一些生活習(xí)性尚不清楚，所以在飼養(yǎng)過程中出現(xiàn)了諸多問題，其中疾病是影響大鯢養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素之一。已往在大規(guī)模養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的主要疾病都是由細(xì)菌引起(陳祥云，陳新民.大鯢病害研究綜述[J].漁業(yè)現(xiàn)代化，2006(5)：25-267.)但2010年曾令兵利用EPC細(xì)胞在國內(nèi)外首次成功地從患典型出血病的大鯢幼魚、成魚體內(nèi)分離到病毒。從患病魚體內(nèi)分離的病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)物，細(xì)胞可發(fā)生典型的細(xì)胞病變效應(yīng)，病毒可通過連續(xù)傳代進(jìn)行培養(yǎng)。病毒核酸特異性PCR反應(yīng)可擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的DNA片段，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序與比對(duì)分析，其序列與蛙虹彩病毒序列的同源性達(dá)到了99％以上，被初步確認(rèn)為大鯢虹彩病毒(Giant?salamander?iridovirus，GSIV)。

目前大鯢的人工養(yǎng)殖發(fā)展迅速，已形成經(jīng)濟(jì)價(jià)值巨大的產(chǎn)業(yè)。但是，大鯢虹彩病毒造成的影響隨著大鯢養(yǎng)殖規(guī)模與范圍的不斷擴(kuò)大而日趨嚴(yán)重，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，有必要建立一種準(zhǔn)確、快速、靈敏的檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行監(jiān)控，保證大鯢養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。近年來，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time?fluorescent?quantitative?PCR)以其特異性高、靈敏度高、可定量、有效解決PCR污染問題及自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、微生物和動(dòng)植物疾病檢疫方面得到了廣泛應(yīng)用(Petersen?E，Edvinsson?B，Lundgren?B，et?al.Diagnosis?of?pulmonary?infection?with?Toxoplasma?gondii?in?immunocompromised?HIV-positive?patients?by?real-ime?PCR[J].Eur?J?Clin?Microbiol?Infect?Dis，2006，25(6)：401-404.；Goldschmidt?P，Rosne?H，Saint-jean?C，et?al.Effects?of?topical?anaesthetims?and?fluorescein?Oil?the?real-time?PCR?used?for?the?diagnosis?of?Herpesviruses?and?Acanthamoeba?keratitis[J].Br?J?ophthalmol，2006，90(11)：1354-1356.；Regis?S，Grossi，Laldi?S，et?al.Diagnosis?of?Pelizaeus-Merzbacher?disease：detection?of?proteolipid?protein?gene?copy?numher?by?real-time?PCR[J].Neurogenetics，2005，6(2)：73-78.；Lobetti?R?G，Tasker?S.Diagnosis?of?feline?haemoplasma?infection?using?a?real-time?PCR?assay[J].J?S?Afr?Vet?Assoc，2004，75(2)：94-99.；Ordinaire?I，Simon?A，F(xiàn)realle?E，et?al.Real-time?quantitative?PCR?for?toxoplasmosis?diagnosis[J].Ann?Biol?Clin，2005，63(1)：67-73.；Ovarnstrom?Y，James?C，Xayavong?M，et?al.Comparison?of?real-time?PCR?protocols?for?differential?laboratory?diagnosis?of?amebiasis[J].J?Clin?Microbiol，2005，43(11)：5491-5497.；Knorr?L，F(xiàn)ox?J?D，Tilley?P?A，et?al.Evaluation?of?real-time?PCR?for?diagnosis?of?Bordetella?pertussis?infection[J].BMC?Infect?Dis，2006(6)：62-64.；Vanden?B?R，Kuijper?E?J，Vancopdenraer?C?L，et?al.Rapid?diagnosis?oftoxinogenic?Clostridium?difficile?in?faeeal?samples?with?internally?controlled?real-time?PCR[J].Ciin?Microbiol?Infect，2006，12(2)：184-186.；Machida?U，Kami?M，F(xiàn)ukuI?T，et?al.Real-time?automated?PCR?for?early?diagnosis?and?monitoring?of?cytomegalovirus?infection?after?bone?marrow?transplantation[J].J?Clin?Microbiol，2000，38(7)：2536-2542.)筆者建立了檢測(cè)大鯢虹彩病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，旨在對(duì)大鯢虹彩病毒進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。而傳統(tǒng)的PCR法約需7個(gè)小時(shí)左右才能完成。