[發明專利]一種酶解-HPLC法檢測依諾肝素的方法

有效

• 申請號: 201110241617.9
• 申請日: 2011-08-22
• 公開（公告）號: CN102323355A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 李建科
• 申請（專利權）人: 深圳市天道醫藥有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所 11130
• 代理人: 王為

1.一種用HPLC法檢測依諾肝素酶解后的二糖和四糖含量的方法，所述方法包括下述步驟：

a、依諾肝素的完全酶解：向濃度為10-200mg/ml的依諾肝素溶液中，加入酶I∶酶II∶酶III＝8∶1∶2的混合酶溶液，室溫下酶解48小時；

b、HPLC法分析：取降解產物做SAX-HPLC分析；

c、二、四糖單元種類和含量的計算：根據現有的標準雙糖和四糖的洗脫時間，確定供試品二、四糖單元的種類和含量，計算其中8個雙糖和1個四糖各自所占百分含量；

d、質量是否合格的判斷：計算其中8個雙糖和1個四糖各自所占百分含量，觀察其含量是否符合正常范圍，并由此判斷試品依諾肝素質量是否合格。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟a中所述對應于1mg降解底物的混合酶溶液用量為酶I∶酶II∶酶III＝0.3mIU∶0.75mIU∶1.5mIU。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟a中所述酶I，酶II，酶III分別代表：肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟a中所述的酶解，是將依諾肝素溶液，緩沖液B，肝素酶I溶液、肝素酶II溶液、肝素酶III溶液混合，放置48小時進行酶解。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟b中所述的HPLC法，其色譜條件如下：

??檢測器/波長 ??紫外檢測器/234nm ??色譜柱 ??Waters?Spherisorb?S5-SAX，4.6mm×250mm×5μm ??預柱 ??Waters?Spherisorb?SAX，4.6mm×10mm×5μm ??柱溫 ??室溫 ??流動相 ??洗提液A和洗提液B進行梯度洗脫 ??流速 ??1.40ml/min ??進樣量 ??25μl ??采集時間 ??70min

洗脫采用梯度洗脫。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟d中所述8種雙糖為：IV-S、?II-A、III-A、II-S、III-S、I-A、I-S、IV-A；1個四糖為：3-o-sulf。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟d中所述8種雙糖含量范圍分別是IV-S(1.67％±0.09％)、II-A(2.77％±0.15％)、III-A(1.06％±0.10％)、II-S(9.92％±0.30％)、III-S(5.44％±0.14％)、I-A(1.56％±0.07％)、I-S(60.66％±0.67％)、IV-A(1.67％±0.22％)，四糖3-o-sulf含量范圍是(5.04％±0.32％)。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于：雙糖和四糖的洗脫順序如下表：

?雙糖～四糖 ??保留時間(分鐘) ??分子量 ?IV-A(red) ??4.5 ??401 ?峰1(連接區域)(red) ??11.0 ??734 ?IV-Sgal(red) ??11.9 ??461 ?IV-S(red) ??12.2 ??461 ?II-A(red) ??13.7 ??503 ?雙糖1+2(1，6-anhydro結構) ??15.2 ??443 ?III-A(red) ??16.0 ??503 ?II-Sgal(red) ??16.4 ??563 ?II-S(red) ??18.0 ??563 ?III-S(red) ??21.5 ??563 ?I-A(red) ??25.0 ??605 ?雙糖3(1，6-anhydro結構) ??26.4 ??545 ?峰2 ??29.5 ??1066 ?I-S(red) ??29.9 ??665 ?峰3(四糖3-O-Sulf) ??35.0 ??965 ?四糖1(1，6-anhydro結構) ??43.3 ??1210