[發明專利]一種肝素黃桿菌肝素酶I、II、III的制備方法

有效

• 申請號: 201110241260.4
• 申請日: 2011-08-22
• 公開（公告）號: CN102286448A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 馬小來;史紹鵬;李鋰
• 申請（專利權）人: 深圳市海普瑞藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12R1/20
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所 11130
• 代理人: 王為

1.一種肝素黃桿菌肝素酶的制備方法，所述方法包括下述步驟：

(1)肝素酶的粗酶液的發酵制備：

將肝素黃桿菌從平板或斜面上刮取兩環菌接到50ml種子培養基中，23℃，150rpm，培養1天，然后按5％接種量接入發酵培養基，23℃，150rpm，培養2-3天。菌液10000rpm，4℃離心15-30分鐘，收集沉淀，懸浮在100ml、50mM?Tris-HCl①緩沖液中，冰浴超聲1小時；4℃，10000rpm，離心30min，向其中滴加0.5g/ml的魚精蛋白8ml，攪拌，4℃，10000rpm，離心30min，上清即為粗酶液；

(2)粗酶的SP柱分離：

將步驟(1)所得粗酶液上一根用10-50mM的Tris-HCl^②平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，然后以緩沖液中氯化鈉線形梯度0-0.5M洗脫，分別收集洗脫液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的洗脫液，兩種酶呈兩個活性峰I和II；

將活性峰II洗脫液透析后上一根用50mM?Tris-HCl^①緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0.2M洗脫，分別收集洗脫液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的洗脫液，呈兩種酶呈兩個活性峰III和IV；

(3)肝素酶I的純化：

步驟(2)活性峰III洗脫液透析后上一根用Tris-HCl^③緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl^③緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0.5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；上一根用50mM?Tris-HCl^②緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0.5M洗脫，收集洗脫液中具有肝素酶活性的組分，以截留分子量10kd的超濾離心管濃縮，得到肝素酶I；

(4)肝素酶III的純化：

步驟(2)活性峰IV洗脫液透析后上一根用Tris-HCl^④緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl^④緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0.5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；上一根用50mM?Tris-HCl^②緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0.5M洗脫，收集洗脫液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的組分以截留分子量10kd的超濾離心管濃縮，得到肝素酶III；

(5)肝素酶II的純化：

步驟(2)活性峰I洗脫液透析后上一根用10mM?Tris-HCl^⑤緩沖液平衡過的HEP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl^⑤緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0.1M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；然后上一根用50mM磷酸-磷酸鈉緩沖液平衡過的HA柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-1.5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；然后上一根用Tris-HCl^②緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl^②緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0.5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析，以截留分子量10kd的超濾離心管濃縮，得到肝素酶II。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟(1)中所述種子培養基的組成為牛肉膏0.5％、蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl為0.5％、pH7.0。

3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟(1)中所述發酵培養基組成為肝素8，K₂HPO₄?2.5，NaH₂PO₄?2.5，NH₄Cl?2.0，MgCl₂?0.5，組氨酸0.5，甲硫氨酸0.5，微量元素NaMoO₃、CuCl₂、FeCl₂、CoCl₂、MnCl₂、CaCl₂共1×10^-4M，單位為g/L。