[發明專利]一種蛇毒類凝血酶蛋白的制備方法

無效

• 申請號: 201110241205.5
• 申請日: 2011-08-22
• 公開（公告）號: CN102296055A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發明（設計）人: 陸一鳴;王俊杰;胡振林;王凱慧;魏玉保;孫樹漢
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N9/74
• 分類號: C12N9/74;C12N15/70;C12N15/57;C12N15/10;C12R1/19;C12R1/92
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種蛇毒類凝血酶蛋白的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)制備蛇毒類凝血酶基因：

a)小心分離新鮮蛇毒毒腺，提取組織RNA，并進一步提取分離mRNA，反轉錄獲得cDNA；

b)cDNA雙鏈進行末端補平，補平后的cDNA末端加上EcoR?I和Hind?III酶切位點；

c)已加酶切位點的cDNA雙鏈片段用EcoR?I和Hind?III限制性內切酶酶切，酶切片段連入T7載體，連接產物加入到包裝蛋白中進行噬菌體體外包裝；

d)以纖維蛋白原作為特異性底物淘選噬菌體：將纖維蛋白原稀釋至濃度為10μg/ml，用封閉液將其包被在ELISA板上；包被好的ELISA板，每孔加入包裝好的噬菌體100μl，室溫孵育2小時；用TBST溶液洗板5次，加洗脫液在室溫孵育20分鐘，從ELISA板上洗脫噬菌體，完成第一輪淘選；

再按上述方法以第一輪淘選噬菌體為基礎，再進行兩輪淘選，獲得強親和性的含目的基因的噬菌體群；

e)從上述噬菌體群中分離培養單個的噬菌體，以SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4為引物，PCR擴增獲得蛇毒類凝血酶基因，如SEQ?ID?NO：1所示；

(2)將蛇毒類凝血酶基因克隆入質粒載體中，構建原核表達載體；

(3)用原核表達載體轉化大腸桿菌；

(4)挑取含表達載體的單克隆菌株在37℃下過夜振蕩培養至A600＝0.6-0.8，加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度為0.7mmol/L，18℃振蕩培養8小時，誘導表達蛇毒類凝血酶蛋白；

(5)收集菌體，-80℃凍存；重新取出菌體，加入裂解液，攪勻，冰上超聲破菌；

(6)在4℃，8000g下離心10分鐘，收集上清，進一步純化制備類凝血酶蛋白。

2.一種克隆獲得蛇毒類凝血酶基因的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)小心分離新鮮蛇毒毒腺，提取組織RNA，并進一步提取分離m?RNA，反轉錄獲得cDNA；

(2)cDNA雙鏈進行末端補平，補平后的cDNA末端加上EcoR?I和Hind?III酶切位點；

(3)已加酶切位點的cDNA雙鏈片段用EcoR?I和Hind?III限制性內切酶酶切，酶切片段連入T7載體，連接產物加入到包裝蛋白中進行噬菌體體外包裝；

(4)以纖維蛋白原作為特異性底物淘選噬菌體：將纖維蛋白原稀釋至濃度為10μg/ml，用封閉液將其包被在ELISA板上；包被好的ELISA板，每孔加入包裝好的噬菌體100μl，室溫孵育2小時；用TBST溶液洗板5次，加洗脫液在室溫孵育20分鐘，從ELISA板上洗脫噬菌體，完成第一輪淘選；

再按上述方法以第一輪淘選噬菌體為基礎，再進行兩輪淘選，獲得強親和性的含目的基因的噬菌體群；

(5)從上述噬菌體群中分離培養單個的噬菌體，以SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4為引物，PCR擴增獲得蛇毒類凝血酶基因。