[發明專利]基于環介導等溫擴增技術檢測鐮刀菌的引物及試劑盒

無效

• 申請號: 201110240981.3
• 申請日: 2011-08-22
• 公開（公告）號: CN102251055A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 趙格;孫士營;謝立信
• 申請（專利權）人: 山東省眼科研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/77
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南

技術領域

本發明屬于常見病原真菌快速檢測技術領域，具體涉及一種基于環介導等溫擴增技術檢測鐮刀菌的引物及試劑盒。

背景技術

鐮刀菌(Fusarium)廣泛分布于自然界的土壤、水和有機物中，是一種重要的植物病原菌，可侵染多種植物(糧食作物、經濟作物、藥用植物及觀賞植物)，已知的寄主植物達100余種。鐮刀菌侵染寄主植物維管束系統，會引起植物的根腐、莖腐、莖基腐、花腐和穗腐等多種病害，并在生長發育代謝過程中產生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，嚴重影響作物的產量和品質，是生產上最難防治的重要病害之一。另外，鐮刀菌還可感染鱸魚等淡水魚，引起發炎、潰爛，若不及時治療可以發大量死亡。少數鐮刀菌種也可引起人類疾病，包括淺表感染、局部感染和播散性感染途徑，主要取決于患者免疫狀況和感染入侵途徑。對于免疫力正常患者，外傷或外來異物導致皮膚或粘膜破損是鐮刀菌感染的主要途徑，其中以角膜炎和甲癬最常見。在鐮刀菌導致的眼科疾病中，植物性外傷是引起角膜感染的主要因素。并且鐮刀菌產生蛋白酶、膠原酶及多種毒素破壞組織，常致角膜潰瘍，在真菌性角膜炎中居于首位。

研究發現引發角膜炎的鐮刀菌主要是茄病鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和串珠鐮刀菌。對免疫缺陷人群，70％以上的鐮刀菌病表現為播散性感染，最常累及皮膚，其次是肺和鼻竇。對于鐮刀菌引發的感染，特別是角膜炎，若不及時治療就有致盲的危險，所以早期的有效診斷對于指導正確的用藥治療尤為重要。

現有的鐮刀菌的檢測方法有病變標本真菌分離培養法、病變標本顯微鏡檢法、血清學實驗檢測法、共焦顯微鏡觀察直接觀察法和PCR檢測法等。其中病變標本真菌分離培養周期較長，過程繁瑣，不利于快速的早期診斷；病變標本直接鏡檢雖然快速簡單，但是陽性率不高；血清學方法對于淺表和局部感染的檢測有效性較差，且不利于其他生物的檢測；共焦顯微鏡直接觀察病灶處有無鐮刀菌菌絲或孢子是一種很直接的檢測方法，但是共焦顯微鏡并不是很普及的檢測儀器，限制了其推廣應用。普通的PCR檢測方法雖然靈敏特異，但成本較高且需要專門的PCR儀。而環介導等溫擴增(loop-mediated?isothermalamplification，LAMP)技術不但具有普通PCR檢測方法的靈敏特異性，還可以在等溫條件下快速、高效、特異地擴增靶序列；且操作簡便，不需要昂貴的儀器和試劑，成本低，已在病原微生物檢測領域顯示出廣闊的發展前景，但目前尚未見用環介導等溫擴增方法檢測鐮刀菌的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于環介導等溫擴增技術檢測鐮刀菌的引物及試劑盒，以便快速準確的檢測鐮刀菌。

本發明的檢測鐮刀菌的環介導等溫擴增引物，是根據鐮刀菌18s?rRNA的種間同源區域特殊設計的LAMP引物：包括可以識別靶DNA六個不同序列的兩個內引物(正向內引物和反向內引物)和兩個外引物(正向外引物和反向外引物)，內引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈，其引物序列分別為SEQ?ID?NO：1～4。

正向內引物Fu-FIP：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；

反向內引物Fu-BIP：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示；

正向外引物Fu-F3：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示；

反向外引物Fu-B3：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示。

本發明的鐮刀菌核酸等溫擴增檢測試劑盒包括：

1)LAMP反應液，LAMP反應液由以下組份組成：10×Thermopol反應緩沖液，dATP、dGTP和dCTP各1.0～2.0mM，dTTP、dUTP各0.5～1.5mM，MgSO₄4～12mM，Betaine?0.8～1.6M；正反向內引物各1.2～1.8μM和正反向外引物各0.2～0.3μM；

其中所述的10×Thermopol反應緩沖液中含有200mmol?pH8.8的Tris-HCl、100mmol/L?KCl、100mmol/L(NH₄)₂SO₄、20mmol/L?MgSO₄和1％Triton?X-100；

2)UNG酶，為1U/μL尿嘧啶DNA糖基化酶；

3)Bst?DNA聚合酶，內裝8U/μL的Bst?DNA聚合酶；

4)顯色劑，內裝核酸染料GeneFinder^TM；

5)陽性對照核酸，為含鐮刀菌DNA的質粒。

使用上述試劑盒檢測鐮刀菌，其具體方法依次包括下列步驟(1)-(3)：