[發明專利]豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒檢測用引物、探針及檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201110240547.5
• 申請日: 2011-08-22
• 公開（公告）號: CN102277455A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 王一成;袁秀芳;徐麗華;李軍星;郭勇
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 張文祎

技術領域

本發明涉及豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒檢測用引物、探針及檢測試劑盒。

背景技術

豬圓環病毒2型（Porcine?circocirus?type2，PCV-2）、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies?virus，PRV）和豬細小病毒（Porcine?parvovirus，PPV）是目前常見的引起豬繁殖障礙病的DNA病毒。目前，很多豬場都同時存在上述三種病毒引起的疾病，給養豬業造成巨大的經濟損失。以上三種病毒常呈現混合感染，在臨床上以受感染母豬產死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔豬為主要特征，不容易區分。

國內外豬病現有常用診斷技術主要包括：臨床診斷、病原診斷、血清學診斷，分子生物學診斷等。臨床診斷主要依據流行病學、臨床癥狀和尸體剖檢來判斷疾病種類，難以做到確診。病原分離是最經典和可靠的病原診斷方法，特異性高，可直接確診，但病毒分離所需時間較長，成本較高。血清學檢測技術有血清中和試驗（Neutralization?test）、凝集性試驗(Agglutination?test)、熒光抗體技術(Fluorescent-labelled?abtibody?technic)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、斑點金免疫滲濾法、膠體金免疫層析法(colloidal?gold?immunochromatography)等。熒光抗體技術具有快速、鑒別準確、可靠、分辨率高等優點，但費用昂貴(需配備熒光顯微鏡)、特異性差、主觀性強（需有經驗的檢驗員），同時難區分非特異性染色。其他血清學技術主要用于檢測血清抗體水平。目前最常用的血清學診斷方法是ELISA，應用很廣，發展很快，是檢測抗體的主要免疫學方法，也是監測豬群抗體水平的主要技術手段，常用于規?；B豬場的免疫水平監測。分子生物學檢測技術包括聚合酶鏈式反應(PCR)、反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT－PCR)、實時熒光定量PCR（Real?Time?Quantitative?PCR）、實時熒光定量RT-PCR（Real?Time?Quantitative?RT-PCR）核酸探針技術、基因芯片檢測技術等。常規單項PCR及實時定量PCR一次只能檢測一種病毒，費時費力，多種病因混合感染時，難以應用常規方法進行早期快速檢測。多重PCR及實時定量PCR可以同時檢測多種病毒，方便快捷，省時省力。

本發明首次將實時定量PCR技術應用于同時檢測豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒檢測領域，提供了針對豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒檢測的特異性引物、探針序列、試劑盒和檢測方法。

發明內容

本發明要解決的第一個技術問題是提供一組特異性強、靈敏度高的同時檢測豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的核苷酸序列，包括引物和探針。

本發明要解決的第二個技術問題是提供快速、準確、使用方便的同時檢測豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的檢測試劑盒。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

本發明提供了檢測豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的引物和探針，具體如下：

1.?通過序列比較，根據PCV?ORF2?基因的序列?(GenBank：EU257513)，在其保守區設計一對引物及一條探針：

1）PCV正義引物（PCV-F）?5'?CCTCCCGCCATACCATAACC?3'?（SEQ?ID?NO：1）；

2）PCV反義引物（PCV-R）5'?CTGATTTCTTTTGTTGTTTGGTTGG?3'?（SEQ?ID?NO：2）；

3）PCV探針（PCV-probe）5'?(FAM)?CCCTTCTCCTACCACTCCCGSTACTTTAC?(ECLIPSE)?3'?（SEQ?ID?NO：3），該探針的5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團ECLIPSE；

其中，S代表兼并堿基G或C。?

2.?通過序列比較，根據PRV?gH基因的序列(GenBank：X58868)，在其保守區設計一對引物及一條探針：

4）PRV?正義引物（PRV-F）5'ACATGGAGGAGCAGCTCATG?3'，（SEQ?ID?NO：4）；

5）PRV?反義引物（PRV-?R）5'?AAGAGCATCAGGGCCTTGAC?3'，（SEQ?ID?NO：5）；

6）PRV?探針（PRV-?probe）：

5’?(TAMARA?)CGCCAACTCCACCATCCCCAGC(ECLIPSE)?3’，?（SEQ?ID?NO：6）。