[發明專利]一種產堿桿菌及利用其制備D-對羥基苯甘氨酸的方法

無效

• 申請號: 201110240379.X
• 申請日: 2011-08-19
• 公開（公告）號: CN102399709A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 陳建波;孫婧;徐毅
• 申請（專利權）人: 上海師范大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P13/04;C12R1/05
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 楊杰民

技術領域

本發明涉及產堿桿菌及其用途，更具體地說是涉及一種產堿桿菌以及利用該產堿桿菌制備D-對羥基苯甘氨酸的方法。

背景技術

D-對羥基苯甘氨酸是一種重要的醫藥原料，用于合成β-內酰胺類抗菌素類藥物，如羥氨芐青霉素、頭孢克羅、頭孢立新、頭孢拉定等抗菌藥物。這些藥物對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、弓形體、螺旋體等均有殺滅作用，在臨床醫學上被廣泛應用，對很多常見病的治療起著重要的作用。已有技術制備D-對羥基苯甘氨酸方法有兩種：化學合成法和酶法。化學合成法的缺點是：工藝復雜、成本高、對環境污染嚴重。酶法制備D-對羥基苯甘氨酸與化學合成法相比具有工藝簡單、產品收率高、能源消耗少、環境污染小等優點，是目前最經濟的工業生產方法。生物酶法制備D-對羥基苯甘氨酸可以分為酶拆分法和酶轉化法兩種方法。酶拆分法以化學法制備的乙酰化DL-HPG為底物，利用氨基酰化酶進行拆分。酶轉化法以DL-對羥基苯海因為底物，利用海因酶將底物轉化為D-對羥基苯甘氨酸。酶拆分法的缺點是：1、產物收率低，最高不超過50％；2、必須事先合成消旋的乙酰化DL-HPG底物，工藝復雜。酶轉化法制備D-對羥基-苯甘氨酸是利用微生物體內產生的D-海因酶DHase將DL-對羥基苯海因水解成為N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸NC-D-p-HPG，然后用化學法或氨甲酰水解酶將NC-D-p-HPG水解脫去氨甲酰基得到D-對羥基-苯甘氨酸。酶轉化法理論上能將底物100％地轉化為單一對映體的氨基酸，但是現在能夠以高產率和高光學純度實現上述轉化制備D-對羥基苯甘氨酸的微生物菌種還很少。所以發明一種能夠促進酶轉化法制備D-對羥基苯甘氨酸的微生物菌種和利用該微生物菌種制備D-對羥基苯甘氨酸的方法是十分必要的。

發明內容

本發明的目的是提供一種促進酶轉化法制備D-對羥基苯甘氨酸的微生物新菌種和利用該微生物新菌種制備D-對羥基苯甘氨酸的方法。

本發明的目的是這樣實現的：

一種產堿桿菌Alcaligenes?sp.SHNU01，菌種保存號CGMCC?NO.3872。

采用上述產堿桿菌作為催化劑制備D-對羥基苯甘氨酸的方法，包括下列步驟：

(1)取產堿桿菌Alcaligenes?sp.SHNU01，CGMCC?NO.3872細胞置于pH值為6～10的磷酸鉀緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液中；

(2)向步驟(1)緩沖溶液中加入濃度為10～200mM的消旋體海因，反應溫度20～50℃，反應時間3～96小時，得N-氨甲酰-D-對羥基苯甘氨酸；

(3)將步驟(2)反應液與NaNO₂反應后分離、純化得D-對羥基苯甘氨酸。

步驟(1)中所述產堿桿菌細胞濃度為濕重5～100g/L。

步驟(2)中所述消旋體海因為對羥基苯海因。

本發明的要點是：從土壤中分離并經過多輪篩選后獲得的新的產堿桿菌，該產堿桿菌菌種于2010年5月24日在中國普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號為CGMCC3872；并利用該產堿桿菌的催化作用選擇性水解反應制備D-對羥基苯甘氨酸。

本發明的具體實施方法是：

1、菌種的富集：

富集：將取自各地的土樣加入到10ml無菌水中，均勻攪拌，待部分沉降后取約1mL上部混合液加入富集培養基中，于28℃，200r/min恒溫振蕩培養約48h。

分離：將經富集培養得到的菌液稀釋適當濃度，各取0.2mL涂布于分離培養基上，28℃培養直到長出足夠大的菌落。

純化：挑取生長良好、菌落大小、形態、顏色不一的菌落劃線接種于普通細菌培養基平板上進行純化；挑取典型單菌落，反復純化，得到純種。

2、菌種的篩選：

雙層瓊脂法篩選：

將分離得到的各菌株點種于普通細菌培養基上，28℃培養21h，覆蓋一薄層45℃左右的含有底物及15g/L瓊脂的Tris-HCl，pH8.0，作為上層，待凝固后于28℃培養24h。直接在菌落上滴加一滴濃度為100g/L的PDAB，對二甲氨基苯甲醛6mol/L?HCl配制，5-10s內呈特異的黃色者為陽性菌株。

微孔快速篩選法復篩：