[發明專利]抗體片段修飾的微梁制備方法和基于抗體片段修飾的微梁免疫傳感檢測系統

有效

• 申請號: 201110240250.9
• 申請日: 2011-08-19
• 公開（公告）號: CN102951600A
• 公開（公告）日: 2013-03-06
• 發明（設計）人: 張青川;鄔林;吳尚犬;伍小平
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: B81C1/00
• 分類號: B81C1/00;B81B3/00;G01L1/04;G01N33/543
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 王旭

技術領域

本發明涉及抗體片段，具體地是抗體F(ab’)₂片段修飾的微懸臂梁(以下也簡稱為微梁)，及其制備方法。本發明還公開了基于所述抗體片段修飾的微梁的免疫傳感檢測系統和檢測方法，所述系統和方法可應用于食品安全、環境污染、生物醫學、科學研究和生產制造等領域的監控和檢測。?

背景技術

免疫傳感技術的原理是基于檢測抗原抗體的特異性配對反應，即針對需要檢測的某種靶標分子(抗原)，通過生物免疫(把抗原注入小動物體內產生的)方法，產生出相應的探針分子(抗體)，提取、純化出這種探針分子，再利用抗原抗體的特異性結合去檢測樣品中的靶分子。已有的免疫傳感技術如：酶聯免疫吸附試驗(ELISA，原理是利用抗原與抗體的特異性反應與酶標的催化放大來進行)和免疫熒光法(IF，原理是用熒光片段標記抗原或抗體)，均需要標記物來示蹤抗原抗體的反應結果，就是說僅有抗體，并不能建立相應的檢測方法，還需要有酶標物或熒光標記物或蛋白復合物。而一些難制備的靶標分子的標記物價格昂貴，或幾乎不可能制備或購買。同時酶聯免疫試劑盒和蛋白芯片的檢測從原理操作上都要求每一步反應完后進行清洗，標記過程繁瑣耗時，是事后的檢測，不能實時，原位、在線的檢測。?

基于表面應力檢測的微懸臂梁免疫傳感技術是近年出現的一種新的免疫生化傳感方法^[1]，其原理是：把探針(抗原或抗體)分子用直接或間接的方式固定(修飾)到微梁一側的鍍金層上，當被檢測樣品液中的靶分子與微梁金表面上的探針分子發生免疫生化反應時，會使微梁表面應力改變，從而導致微梁彎曲變形，通過光學或電學方法檢測這種變形的過程，可得到免疫生化反應的實時信息。基于免疫特異性識別建立的微梁免疫傳?感技術與傳統的需要標記物的免疫傳感方法相比，它無需使用任何酶標、熒光物質和放射性作為反應示蹤劑，消除了標記過程的影響，靈敏度高(比酶聯免疫試驗高數倍^[2-4])，還可以通過監測微梁變形來實時、定量的監測抗原抗體的反應過程，得到更豐富的免疫生化反應的信息。經過這些年的發展，微梁傳感被作為一種新興技術，在生物工程和環境污染監測技術等方面與傳統的方法進行對比研究，如RNA轉錄因子、酶、汞排放及揮發性化合物等，優于常規的酶聯免疫方法。但即使如此，微懸臂梁免疫傳感技術的檢測靈敏度還不足以在成本方面獲得相對于常規酶聯免疫法的巨大優勢，即如果微懸臂梁免疫傳感技術的靈敏度或檢測極限只比酶聯免疫法高數倍，而微懸臂梁免疫傳感技術的設備成本與酶聯免疫相對較高，使得微懸臂梁免疫傳感技術難以商業化。?

目前，國內外文獻報道的方法主要是利用具有雙功能基團的疏基化試劑的疏基(-SH)抓住微梁表面的金表面，和另一功能團抓住抗體，實現抗體在微梁鍍金表面上的固定。例如先將巰基化試劑11-羧酸硫醇結合到微梁的金表面，活化其上的羧基，使之與抗體上的氨基結合來固定抗體(圖2)。或用一種巰基化試劑鹽酸硫醇亞胺，通過與抗體反應，使抗體連接一個帶巰基的分子基團，再通過這個巰基將抗體聯結到微梁的金表面上(中國專利CN101407548)(見圖3)。這些方法固定抗體，存在如下共同的問題，(1)Y字形抗體(見圖1)的Fc段或Fab段的頂端部，會等概率的被固定在金表面上，沒有方向性^[5]。而當Fab段的頂端被固定在金表面上時，結合位點被遮擋，限制了抗體的抗原結合位點與抗原的充分結合，從而降低了微梁傳感靈敏度；(2)抗體與微梁之間存在不同數目C原子的單鏈分子，降低了抗原抗體反應產生的應力傳遞到梁上的效率。由此可見，中國專利CN101407548中公開的方法的靈敏度與酶聯免疫法相比僅提高數倍，還無法達到商業化或用于極微量被分析物的檢測。?

因此，在本領域中存在著改進微梁表面與抗體的結合和設計從而進一步提高微梁免疫傳感靈敏度和效率的需求。?

發明內容

綜上所述，在已有的微梁免疫傳感技術報道中，最突出的問題就是檢?測靈敏度。影響微梁免疫傳感器靈敏度的因素主要有三個方面：①抗體的靈敏度(或抗體與抗原結合的親和性)、②微梁上抗體的固定方法和③微梁的設計與信號讀出。由于抗體的靈敏度和微梁的規格與信號讀出方式在微梁免疫傳感器系統成型之后就無法改變，唯一可變的是微梁表面抗體的固定方法。一種合適的微梁表面抗體的修飾方法，能使固定在微梁表面的抗體與樣品溶液中的抗原充分結合，并能高效地將抗原抗體結合所產生的應力變化傳遞到微梁表面。抗體在微梁表面固定的方向性、密度、活性以及抗體與微梁表面之間的聯接分子的長度與剛性都有可能影響最終檢測的靈敏度。?