[發明專利]一種新型隱球菌莢膜多糖的制備方法

無效

• 申請號: 201110240065.X
• 申請日: 2011-08-22
• 公開（公告）號: CN102952201A
• 公開（公告）日: 2013-03-06
• 發明（設計）人: 史東東;何永勝;周澤奇;李寧;粟艷;王東東;彭潔
• 申請（專利權）人: 天津貽諾琦生物工程有限公司
• 主分類號: C08B37/02
• 分類號: C08B37/02;C12P19/04;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及真菌的多糖制備領域。具體而言，本發明涉及制備新型隱球菌的莢膜多糖。

背景技術

新型隱球菌(Crytococcus?Neoformans)是一種重要的條件致病性真菌，主要存在于養鳥場或被鳥類排泄物污染的土壤中，在AIDS和HIV相關隱球菌病患者房間的灰塵和空氣中也能夠找到新型隱球菌的病原體。新型隱球菌常感染免疫低下或免疫缺陷的患者，從而引起臨床癥狀，甚至危及生命。

近年來由于廣譜抗菌藥物、腎上腺皮質激素、腫瘤化器官移植后免疫抑制劑的長期廣泛應用，以及艾滋病的流行，真菌性腦膜炎明顯增多。而新型隱球菌性腦膜炎(隱腦)是由新型隱球菌所致的最常見的中樞神經系統真菌感染。隱球菌性腦膜炎是一種預后嚴重的深部真菌感染，早期誤診率達90％，死亡率和嚴重病殘率分別高達25％～60％和20％以上(廖萬清等，Infect?Dis?Info，2000，Vol.13，No.2，p86)。因診斷方法有限，實驗室難以快速提供早期診斷指標。國外實驗室已開展了乳膠凝集實驗檢測血液和腦脊液中隱球菌莢膜多糖抗原，使早期診斷率得以提高(王鑫等，腦與神經疾病雜志2008年，第16卷，第4期，409-411頁)。

而測定抗原作為新型隱球菌感染診斷方法的關鍵，便是得到制備單克隆抗體的免疫原莢膜多糖，即葡萄糖醛酰木糖基甘露聚糖。對于新型隱球菌莢膜多糖的提取制備，國內目前還沒有相關的研究報道。

國外的研究報道常用以下方法制備新型隱球菌莢膜多糖(THOMAS?R?et?al.INFECTION?AND?IMMUNITY，Feb.1971，p.287-294)。通常，用培養罐培養新型隱球菌，經過高壓滅菌后，從離心除去菌體的上清液中提制莢膜多糖。上清液先用0.45um濾膜過濾，然后超濾濃縮，并向濃縮液中加入醋酸鈉和冰醋酸，接下來用乙醇沉淀出粗制莢膜多糖。然后用氯仿/正丁醇(v∶v＝5∶1)進行反復抽提，除去蛋白。再用乙醇將莢膜多糖沉淀出來，離心收集沉淀，將沉淀溶于去離子水，透析，凍干得到精制莢膜多糖。

由于氯仿是有毒有害的化學危險品，有致癌的危險性，對工作條件、人員保護、污水處理等有較高要求。因此，在莢膜多糖的提取制備過程中，應該想辦法盡量避免使用毒害性較大的有機化學試劑。

另外有人嘗試用層析法純化新型隱球菌莢膜多糖(R.Mariano?Andrade，et?al.Cellular?Immunology?222(2003)116-125)。但這種方法的缺點是操作復雜，處理量小，成本高，不易于規?；a。

目前，本領域迫切需要開發一種使用于從新型隱球菌中提制莢膜多糖的簡便、高效、低成本的方法，并能夠有效的避免使用有毒有害的化學試劑。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用十六烷基三甲基溴化銨來制備新型隱球菌莢膜多糖的方法。

本發明所采用的新型隱球菌購買自中國醫學微生物菌種保藏管理中心。

本發明技術方案如下：

步驟：

1)新型隱球菌培養采用通用的白色念珠菌培養條件，具體地說培養基采用YM肉湯培養基，成分為每升培養基含3g酵母提取物，5g蛋白胨，3g麥芽糖提取物，10g?D-葡萄糖。培養溫度為30℃，震蕩速度為200rpm，培養時間大約36h，至菌濃度達到對數期后期；

2)菌液高壓滅菌，離心除去菌體，得上清液；

3)上清液中邊攪拌邊緩慢加入醋酸鈣粉末至終濃度5％。再加冰醋酸調pH值至5.0左右；

4)向上述溶液中加入95％的乙醇，4℃靜置過夜，離心分離沉淀，干燥，得到新型隱球菌抗原粗提物；

5)抗原粗提物溶于水，NaCl粉術至終濃度0.2M，邊攪拌邊按多糖總質量的3倍邊攪拌邊緩慢加入CTAB粉末，靜置1小時后，離心，沉淀用乙醇洗滌兩次；

6)沉淀重新溶解后加入氯化鈉溶液，加入乙醇，使多糖沉淀；

7)沉淀再次用乙醇洗滌兩次，溶于水后測定多糖濃度；

8)莢膜多糖溶液凍干，即得到精制新型隱球菌莢膜多糖抗原。

本發明使用十六烷基三甲基溴化銨進行新型隱球菌莢膜多糖的制備，有效的避免使用有毒有害的化學試劑，并且省略了凝膠層析的過程，不但使得制備工藝簡單化，同時能制備出高純度的新型隱球菌莢膜多糖。

實施例1，用本發明的制備方法提取新型隱球菌莢膜多糖，其步驟如下：