[發明專利]用于制備甲狀腺素和清蛋白的結合體的方法

無效

• 申請號: 201110237985.6
• 申請日: 2011-08-18
• 公開（公告）號: CN102372775A
• 公開（公告）日: 2012-03-14
• 發明（設計）人: 笠置典之;松野忠宏
• 申請（專利權）人: 富士膠片株式會社
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K1/113
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 陳平

技術領域

本發明涉及一種用于制備甲狀腺素和清蛋白的結合體(conjugate)的方法。

背景技術

甲狀腺素(T4)是由甲狀腺分泌的一種類型的甲狀腺激素，并且其由以下所示的結構式表示。通常，甲狀腺素(T4)影響全身的細胞并且加速細胞代謝率。除甲狀腺素以外，三碘甲腺原氨酸(T3)已知作為甲狀腺激素，并且甲狀腺素(T4)占了在血液中循環的甲狀腺激素的大部分。

甲狀腺素和牛血清清蛋白(BSA)的結合體(以下稱為“T4-BSA”)被用作用于制備抗-甲狀腺素抗體的多元半抗原(polyhapten)等。此外，T4-BSA被用于T4等的競爭性測試。本發明人已經獲得了T4等的競爭性測試的結果，其表明T4-BSA的性能取決于T4-BSA的純度，而非T4對于BSA的標記指數。由于T4-BSA生產包括使用過量的T4衍生物，因此經由常規技術，例如通過使用水性溶劑進行的透析或凝膠過濾，不能完全移去未反應的T4衍生物。

關于用于消除在其中半抗原與指示劑組分連接的免疫測定中由半抗原示蹤物的不穩定性和非特異性連接所引起的不利分析結果的技術，已經知道這樣的半抗原示蹤物復合體，其包含直接或經由間隔基團與指示劑組分連接的半抗原以及能夠特異性地與指示劑組分連接的抗體(參見日本專利公布(Kokai)H08-233812A(1996))。根據用于制備這樣的復合體的方法，將針對指示劑組分的抗體和與指示劑組分連接的半抗原在水溶液中混合，并且將有機溶劑(例如，乙腈)加入到水溶液中，以改善與指示劑組分連接的半抗原的溶解性。

然而，迄今還沒有獲知包括使用有機溶劑如乙腈來純化T4-BSA的技術。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種用于制備具有較高純度的甲狀腺素和清蛋白的結合體的方法。

本發明人已經進行了深入細致的研究以實現以上目的。作為結果，他們發現，通過使用具有給定酸度的混合水性溶劑純化甲狀腺素和清蛋白的結合體，可以更有效率地移去未反應的甲狀腺素衍生物。本發明基于這樣的發現得以完成。

本發明提供一種用于制備甲狀腺素和清蛋白的結合體的方法，所述方法包括：

步驟(a)，其中將具有要與清蛋白連接的羧基的甲狀腺素中的羧基轉化為活性酯，并且使所述甲狀腺素與清蛋白反應，以制備甲狀腺素和清蛋白的結合體；和

步驟(b)，其中使用酸性混合水性溶劑純化所述結合體，在所述酸性混合水性溶劑中，所述具有要與清蛋白連接的羧基的甲狀腺素溶解，但是清蛋白不沉淀。

優選地，在步驟(b)中，通過在所述混合水性溶劑中洗脫未反應的具有要與清蛋白連接的羧基的甲狀腺素而純化所述結合體。

優選地，在步驟(b)中，通過將在步驟(a)中得到的反應產物在所述混合水性溶劑中透析而純化所述結合體。

優選地，在步驟(b)中，將結合體經由凝膠過濾進行純化。

優選地，所述混合水性溶劑是水、乙腈、和三氟乙酸的混合物。

優選地，步驟(a)在中性或堿性條件下進行。

本發明還提供一種通過本發明的上述方法得到的甲狀腺素和清蛋白的結合體。

根據本發明的制備方法，可以制備具有較高純度的甲狀腺素和清蛋白的結合體。通過本發明的方法制備的結合體在例如ELISA或競爭性測試的應用中能夠產生較高的信號靈敏度。

附圖說明

圖1顯示通過在實施例中進行的熒光粒子方法進行評價的結果。

圖2顯示通過在實施例中進行的熒光粒子方法進行評價的結果。

具體實施方式

本發明的制備方法包括：步驟(a)，其中將具有要與清蛋白連接的羧基的甲狀腺素中的羧基轉化為活性酯，并且將所述甲狀腺素與清蛋白反應，以制備甲狀腺素和清蛋白的結合體；和步驟(b)，其中使用酸性混合水性溶劑純化所述結合體，在所述酸性混合水性溶劑中，所述具有要與清蛋白連接的羧基的甲狀腺素溶解，但是清蛋白不沉淀。

其中在本發明的酸性混合水性溶劑中“清蛋白不沉淀”的條件是其中“清蛋白溶解或懸浮”在其中的條件。