[發明專利]一種多段DNA并行組裝的方法

在審

• 申請號: 201110235913.8
• 申請日: 2011-08-17
• 公開（公告）號: CN102296059A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發明（設計）人: 石振宇
• 申請（專利權）人: 石振宇
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/64;C12N15/66;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 葫蘆島天開專利商標代理事務所(特殊普通合伙) 21230
• 代理人: 魏勇

1.?一種多段DNA并行組裝的方法，其特征是：

對待組裝片段進行克隆，得到符合“廣義單元載體”結構的單元載體；

根據單元載體的“組裝職能”選出一系列含有不同待組裝片段的廣義單元載體，形成“可組裝隊列”；

對“可組裝隊列“進行“隊列并行組裝”；

具體步驟：

(1)首先，根據組裝實施者的需要，將“待組裝片段”克隆到“空單元載體”當中形成“單元載體”；取含有待組裝片段的“單元載體”和其他“廣義單元載體”構成至少一種“初始可組裝隊列”；然后，對“初始可組裝隊列”進行“隊列并行組裝”，直到形成的“可組裝隊列”中單元載體數量等于1；最后隊列中所得的1個載體，包含按照組裝實施者需要設計順序排列的所有待組裝片段的組裝產物；

并且，

(2)組裝若在細胞內發生，則所需的重組酶由“輔助質粒”表達；組裝若在細胞外發生，則所需的重組酶以蛋白形式直接加入；

并且，

(3)當“隊列并行組裝”需要時，組裝過程中有“輔助質粒”、“組裝宿主”、“回收載體”的輔助；

所述“廣義單元載體”包括“單元載體”和“組裝宿主”；

所述“單元載體”的結構特征如下：“單元載體”結構具有以下2種可能性：

(1)一種是含有單重構位點“單元載體”，按序列順序依次包括：左臂、左反應端、待組裝片段、右反應端、右臂、拓撲重構位點、接左臂；

或者，

(2)另一種是含有雙重構位點單元載體，按序列順序依次包括：固定臂、回收重構位點、左臂、左反應端、待組裝片段、右反應端、右臂、拓撲重構位點、接前述固定臂；

所述“待組裝片段”連接到“空單元載體”當中形成含有“待組裝片段”的“單元載體”；

所述“組裝宿主”是“待組裝片段”長度為0的“單元載體”，具有如下結構特征：固定臂、回收重構位點、左臂、左反應端和右反應端有至少其一、右臂、拓撲重構位點、接前述固定臂；

所述“廣義單元載體”具有如下特征：

(1)?“廣義單元載體”的“組裝職能”類型的差別在于左反應端、右反應端、拓撲重構位點、回收重構位點的差別；

并且，

(2)?“廣義單元載體”有至少1種類型的“組裝職能”；

并且，

(3)不同種類型“組裝職能”的“廣義單元載體”的反應端和重構位點的選擇要滿足：任何一種“組裝職能”的“廣義單元載體”，并且至少存在一種“組裝職能”的“廣義單元載體”與其“互相匹配”;

并且，

(4)?“廣義單元載體”的“組裝職能”的所有種類要滿足：對于任意數量待組裝片段，至少存在一種“可組裝隊列”；

所述“回收載體”的結構特征如下：

(1)?“回收載體”具有回收重構位點、左反應端、右反應端、拓撲重構位點、接前述固定臂4個重組位點當中至少其中2個；

并且，

(2)“回收載體”與“匹配”的“廣義單元載體”進行“載體置換”的目的產物仍然為“廣義單元載體”；

所述“待組裝片段”，是組裝實施者需要組裝的片段；“待組裝片段”的DNA序列，允許是任意不參與反應端、拓撲重構位點、回收重構位點的重組的，并且不參與復制子和篩選標記的篩選的DNA序列；?

所述待組裝片段的“左反應端”和“右反應端”是具有發生重組能力的DNA序列；并且，在“組裝反應”中，同一個單元載體內的左反應端和右反應端不具有互相重組能力；并且，在“組裝反應”中，來自不同“組裝職能”的“廣義單元載體”的左反應端和右反應端重組后消失或者變為在該重組酶下沒有重組活性的DNA序列；并且，“左反應端”和“右反應端”來自于空單元載體、或者來自于待組裝片段；

所述“拓撲重構位點”是序列特異性重組位點，或者是端粒酶位點，或者是相互斷開的2個端粒，并且在同一“組裝反應”中具有發生重組能力，并且在同一“組裝反應”中不具有與同一載體內的反應端或回收重構位點重組的能力；并且，當拓撲重構位點是相互斷開的2個端粒時，含有拓撲重構位點的載體DNA分子在拓撲結構上為線形；?

所述“回收重構位點”是在“組裝反應”中具有發生重組能力的DNA序列，并且在同一“組裝反應”中不具有與同一載體內的任何反應端重組的能力，并且同一“組裝反應”中不具有與同一載體內的拓撲重構位點重組的能力；

所述“固定臂”、“左臂”、“右臂”，是任意在“組裝反應”中不具有與反應端、拓撲重構位點、回收重構位點重組能力的DNA序列，其中包括至少一個復制子和至少一個篩選標記；

所述“置換臂”，是任意不參與反應端、拓撲重構位點、回收重構位點的重組的DNA序列；

所述“回收載體”與“廣義單元載體”的“位點匹配”具有如下3點特征：

(1)?“回收載體”包含的重組位點中與“廣義單元載體”的回收重構位點、左反應端、右反應端、拓撲重構位點重組位點當中至少2個具有發生重組的能力；

并且，

(2)“回收載體”與“廣義單元載體”發生“載體置換”之后的目的產物符合“廣義單元載體”的結構特征，并且具有區別于反應前的篩選特征；

所述“回收載體”與“廣義單元載體”的“載體置換”定義包括如下2個反應的：

(1)?“回收載體”與“廣義單元載體”回收重構位點、左反應端、右反應端、拓撲重構位點4個重組位點當中至少具有其中2個發生重組；

所述“載體置換”的目的產物是“載體置換”反應后，得到反應物當中“廣義單元載體”的“待組裝片段”的、并且符合“廣義單元載體”特征的載體；

所述“廣義單元載體”的“互相匹配”定義為同時滿足以下三個條件：

(1)滿足反應端匹配：2個單元載體，或者至多其中2個單元載體經過“載體置換”之后，其中一個單元載體的右反應端具有與另一個單元載體的左反應端重組的能力，或者其中一個單元載體的左反應端具有與另一個單元載體的右反應端重組的能力；上述兩種情況在同一種酶催化下不同時發生；該重組定義為“反應端匹配重組”；

并且，

(2)滿足重構位點匹配：2個單元載體本身，或者至多其中兩者單元載體經過“載體置換”之后，在同一種酶催化下，其中一個單元載體與另一個單元載體的拓撲重構位點具有重組能力，或者其中一個單元載體與另一個單元載體的拓撲重構位點同時為斷開的端粒形式，或者其中一個單元載體與另一個單元載體的回收重構位點具有重組能力；上述三種情況在同一種酶催化下不同時發生；該重組定義為“重構位點匹配重組”；

并且，

(3)滿足篩選特征匹配：互相匹配的2個單元載體本身，或者至多其中兩者單元載體經過“載體置換”之后，單元載體之間進行組裝的每一步重組產物，都有區別于過反應前體的篩選特征變化；

所述“匹配單元載體對”定義為滿足“互相匹配”關系的2個“廣義單元載體”；?

所述“組裝反應”是“互相匹配”的2個“廣義單元載體”之間發生的重組反應，其特征如下：

(1)在“互相匹配”需要的情況下先與“回收載體”進行所需的“載體置換”，然后發生“反應端匹配重組”和“重構位點匹配重組”2個重組；

并且，

(2)“組裝反應”產物是重組反應產物當中含有其2個“廣義單元載體”前體中所包含的所有待組裝片段的載體；

根據所述單元載體的結構，“組裝反應”的產物，滿足單元載體的定義，仍稱為“單元載體”，具有繼續與匹配的“廣義單元載體”發生組裝反應的能力；

所述“可組裝隊列”是由“廣義單元載體”構成的隊列；并且滿足：當隊列中“廣義單元載體”數量為2N或者2N+1，且N為非負整數，隊列中可挑選出不超過N個互不共用“廣義單元載體”的“匹配單元載體對”，這不超過N個的“匹配單元載體對”發生“組裝反應”后得到的“廣義單元載體”替代原隊列中的這些“匹配單元載體對”，得到的隊列，仍然符合“可組裝隊列”的條件；

所述“初始可組裝隊列”是一個“可組裝隊列”，由含有“待組裝片段”的單元載體和“組裝宿主”構成；并且，隊列中含有“待組裝片段”的“單元載體”的數量與所需組裝的片段的數量一致，并且，每個“單元載體”含有一個待組裝片段；并且，隊列中的單元載體所含的待組裝片段的順序與組裝實施者的目的組裝順序一致；?

所述“隊列并行組裝”定義為如下過程：根據前述定義，在“廣義單元載體”數量為2N或者2N+1(N為非負整數)的“可組裝隊列”中存在的不超過N個互不共用單元載體的“匹配單元載體對”，使這不超過N個“匹配單元載體對”同時并行進行“組裝反應”，并用每個“匹配單元載體對”的“組裝反應”產物或“宿主中間體”替代原“匹配單元載體對”；

廣義單元載體：

(1)所述“廣義單元載體”的“組裝職能”的所有種類進一步滿足：對于任意數量的“待組裝片段”，至少存在一種“匹配組裝隊列”;

并且，

(2)通過挑選“匹配”的“廣義單元載體”，使所述“初始可組裝隊列”滿足“匹配組裝隊列”的要求；

并且，

(3)?對滿足“匹配組裝隊列”要求的“初始可組裝隊列”進行“隊列并行匹配組裝”；

所述“匹配組裝隊列”是滿足以下2個條件的“可組裝隊列”：

(1)當隊列中“廣義單元載體”數量為2N或者2N+1，且N為非負整數，則隊列中存在N個互不共用“廣義單元載體”的“匹配單元載體對”；

并且，

(2)用前述N個“匹配單元載體對”發生“組裝反應”后得到的“廣義單元載體”替代原隊列中的這些“匹配單元載體對”，得到的隊列，仍然符合“匹配組裝隊列”的條件；

所述“隊列并行匹配組裝”定義為如下過程：根據前述定義，在“廣義單元載體”數量為2N或者2N+1，且N為非負整數的“匹配組裝隊列”中存在的N個互不共用“廣義單元載體”的“匹配單元載體對”，使這N個“匹配單元載體對”同時并行進行“組裝反應”，并用每個“匹配單元載體對”的“組裝反應”產物替代原“匹配單元載體對”；

第一種篩選標記：

(1)篩選標記有至少1種，每種“單元載體”的左臂或右臂之一帶有篩選標記；

并且，

(2)“組裝反應”發生時，在“組裝宿主”所在的細胞中，“單元載體”不具有復制能力；并且，“組裝宿主”為染色體；并且，回收載體在特定輔助質粒存在時具有在組裝宿主中復制的能力；

并且，

(3)“單元載體”和“組裝宿主”發生“反應端匹配重組”、“重構位點匹配重組”的其中一組后，利用“單元載體”的篩選標記篩選到中間體進行篩選含有單元載體的篩選標記的中間產物；中間產物再發生“反應端匹配重組”、“重構位點匹配重組”的其中的另一組后，利用“單元載體”所帶的篩選標記的丟失篩選“組裝反應”產物；

并且，

(4)“載體置換”目的產物的篩選：“廣義單元載體”和“回收載體”發生“載體置換”反應的2個重組的其中一個后，利用“回收載體”的篩選標記篩選到中間體；中間體再發生“載體置換”反應的2個重組的其中的另一個，利用“回收載體”在特定復制蛋白下可復制篩選到“載體置換”產物；

并且，

(5)?“輔助質粒”為溫度敏感性載體；并且，在每一步重組前將輔助質粒轉化到宿主細胞；并且，在每一步重組后在“輔助質粒”不具有復制能力的溫度下培養，將輔助質粒從宿主細胞中去除；

第二種篩選標記：

(1)篩選標記有至少2種，每種“組裝職能”的“單元載體”的左臂或右臂各帶有一種篩選標記，且兩臂所帶有的篩選標記互不相同；并且，“組裝反應”發生時，在“組裝宿主”所在的宿主細胞中，“單元載體”不具有復制能力；并且，“組裝宿主”為染色體，有至少2種不同“組裝職能”的組裝宿主，每種含有一種不同的篩選標記；并且，“回收載體”在含有其復制所需的復制蛋白的“輔助質粒”存在時具有在宿主細胞中復制的能力；

(2)“單元載體”和“廣義單元載體”發生“組裝反應”后，利用“廣義單元載體”所帶的篩選標記的被“單元載體”的篩選標記替換來篩選“組裝反應”產物；

(3)?“廣義單元載體”和“回收載體”發生“載體置換”反應的2個重組的其中一個后，利用“回收載體”和“廣義單元載體”2個篩選標記篩選到“載體置換”產物；

第三種篩選標記：

(1)篩選標記有至少3種，每種“單元載體”的左臂和右臂各帶有一種篩選標記，且兩臂所帶有的篩選標記互不相同；

并且，

(2)“組裝反應”所包含的2個重組同時進行；并且，“組裝反應”的目的產物含有不同于其2個“單元載體”前前體的篩選標記組合，使該產物具有通過這種篩選標記組合從重組產物、副產物和未發生反應的單元載體的混合物種篩選出來的操作性;

并且，

(3)組裝過程不需要“回收載體”和“組裝宿主”；

并且，

(4)“輔助質粒”同時表達“組裝反應”包含的2個反應所需的2個重組酶；?

反應端、回收重構位點、拓撲重構位點：

所述反應端、回收重構位點、拓撲重構位點為frt，loxP，Lambda噬菌體的重組位點attB,?attB1,?attB2,?attB3,?attB4,?attB5,?attP,?attP1,?attP2?attP3,?attP4,?attP5,?attL,?attL1,?attL2,?attL3,?attL4,?attL5,?attR,?attR1,?attR2,?attR3,?attR4,?attR5,HK022噬菌體的重組位點attB,?attP,?attL,?attR,?phi80噬菌體的重組位點attB,?attP,?attL,?attR,?P21噬菌體的重組位點attB,?attP,?attL,?attR,?P22噬菌體的重組位點attB,?attP,?attL,?attR；所述反應端為lambda?red重組所需的同源序列；

端粒酶識別位點：

端粒酶識別位點或端粒為原核生物的端粒酶的識別位點或端粒，包括Enterobacteria?phage?N15、Vibrio?phage?VP882、Klebsiella?phage?phiKO2、Yersinia?phage?PY54等的端粒酶識別位點；端粒也為真核生物染色體的端粒；

單元載體、組裝宿主、回收載體：

所述單元載體、組裝宿主、回收載體為原核生物或者真核生物的質粒、也為原核生物或者真核生物的基因組；

單元載體、回收載體的轉化位點：

所述單元載體、回收載體當中含有接合轉化位點，且組裝宿主微生物具備接合轉化能力時，不需要宿主細胞外的分子操作；所述單元載體、回收載體當中不含有接合轉化位點，或且宿主微生物不具備接合轉化能力時，需要有宿主細胞外的分子操作；

重組位點重組酶：

當在細胞外使用重組位點的重組酶時，loxP對應Cre重組酶，frt對應FLP重組酶，Lambda噬菌體的BP重組對應Lambda?Int和IHF，Lambda噬菌體的BP重組對應Lambda?Int、Xis和IHF，，=HK022噬菌體的BP重組對應HK022?Int和IHF，HK022噬菌體的BP重組對應HK022?Int、Xis和IHF，phi80噬菌體的BP重組對應phi80?Int和IHF，phi80噬菌體的BP重組對應phi80?Int、Xis和IHF，P21噬菌體的BP重組對應P21?Int和IHF，P21噬菌體的BP重組對應P21?Int、Xis和IHF，P22噬菌體的BP重組對應P22?Int和IHF，P22噬菌體的BP重組對應P22?Int、Xis和IHF，組裝過程中的重組反應具有在細胞外進行的能力；

其中：

兩個線形載體重組后的單側端粒發生交換，視為在端粒位點發生了一次重組，因為此過程等效于環形載體的兩次重組；例如線形載體A和B端粒標記為T，左右兩個端粒分別用L和R區分，在載體中X和Y之間發生重組，如下：

T^L_A-X_A-Y_A-?T^R_A?+?T^L_B-X_B-Y_B-?T^R_B?è?T^L_A-X_A-Y_B-?T^R_B?+?T^L_B-X_B-Y_A-?T^R_A

重組之后，每個載體的X-Y組合發生交換，同時末端端粒組合也發生交換。