[發明專利]實時熒光定量PCR檢測人接觸蛋白-1(CNTN-1)試劑盒

無效

• 申請號: 201110230102.9
• 申請日: 2011-08-12
• 公開（公告）號: CN102925542A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 劉鵬飛;項斌;劉兵團;沈衛東;王芳軍
• 申請（專利權）人: 江陰市人民醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，通過將組織中的mRNA逆轉錄為cDNA，再通過實時熒光定量PCR精確的檢測人接觸蛋白-1(contactin-1，CNTN-1)基因的mRNA水平。

背景技術

腫瘤嚴重威脅人類健康，早期診斷對提高患者的生存率和生活質量有非常重要的意義。腫瘤的早期發現，早期治療，可降低篩查人群癌癥死亡率，改善預后，提高生活質量，減少放化療藥物的使用率，降低治療費用。然而腫瘤的早期診斷一直是一個沒有攻克的難題，因而發現合適的腫瘤標志并合理的應用腫瘤標志進行早期診斷，具有重要現實意義。

腫瘤早期診斷是對患者的確認或對無癥狀患者的及時診斷。常用的篩查方法有子宮頸癌的巴氏涂片，結直腸癌的隱血試驗，前列腺癌的肛指檢查，食道癌的拉網等，但這些檢查均不理想。計算機斷層掃描、超聲診斷、乳房攝影等檢測的最小極限為1cm(10⁹細胞)直徑的腫瘤。而聚合酶鏈反應可以檢測細胞數在10⁷-10⁸的實體瘤，將腫瘤的早期診斷提高了一個數量級。

Real-time?PCR，即實時監測PCR擴增產物并進行解析的方法，它是在PCR反應體系中加入熒光物質，并通過real-time?PCR檢測系統對PCR反應進程中的熒光信號強度進行實時監測，最終對實驗數據進行分析處理的方法。由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。

肺癌和食管癌是全球和我國死亡率較高的惡性腫瘤，也是我國常見的惡性腫瘤之一，發病率高，預后較差。人接觸蛋白-1(contactin-1，CNTN-1)是一種神經細胞黏附因子(NCAM)，參與了神經系統的發育。但是近年來發現人接觸蛋白-1能介導腫瘤轉移的分子，作為VEGF-C的下游效應分子，可介導肺癌和食管癌等的腫瘤轉移和生長(Su?JL，Yang?PC，Shih?JY，Yang?CY，Wei?LH，Hsieh?CY，Chou?CH，Jeng?YM，Wang?MY，Chang?KJ，Hung?MC，Kuo?ML.The?VEGF-C/Flt-4axis?promotes?invasion?and?metastasis?of?cancer?cells.Cancer?Cell，2006，9(3)：209-223；Liu?P，Zhou?J，Zhu?H，Xie?L，Wang?F，Liu?B，Shen?W，Ye?W，Xiang?B，Zhu?X，Shi?R，Zhang?S.VEGF-C?promotes?the?development?of?esophageal?cancer?via?regulating?CNTN-1expression.Cytokine，2011，55(1)：8-17)。人接觸蛋白-1在肺癌、食管癌細胞中呈高表達，并與肺癌、食管癌等患者預后有密切的關系。因而能靈敏、精確的檢測CNTN-1基因mRNA的表達對于判斷腫瘤患者的預后具有重要的意義。

發明內容

本發明的試劑盒包含逆轉錄反應緩沖液，不含RNA酶的水，Oligo(dT)₁₂，dNTP混合物，RNA酶抑制劑，逆轉錄酶，MgCl₂溶液，聚合酶反應緩沖液，耐熱的Taq?DNA聚合酶，檢測用上游、下游引物和陽性對照DNA。

其中逆轉錄反應體系包括逆轉錄反應溶液(250mM?Tris-HCl(pH?8.3)，375mM?KCl，50mM?DTT)，莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉錄酶，不含RNA酶的水，Oligo(dT)₁₂，dNTP混合物和RNA酶抑制劑。

聚合酶反應體系含有聚合酶反應緩沖液(20mM?Tris-HCl)，MgCl₂溶液(10mM)，耐熱的Taq?DNA聚合酶，dNTP混合物，檢測用上游、下游引物，逆轉錄的cDNA或陽性對照DNA溶液。

檢測用上游引物序列為：5’-GAGCCCAAATATTCTCTGTTGC-3’

下游引物序列為：5’-TGCCTCAGTCATCATGTGTGT-3’

陽性對照DNA序列為：