[發明專利]人類非梗阻性無精子癥相關的精漿微小核糖核酸標志物及其應用

有效

• 申請號: 201110227418.2
• 申請日: 2011-08-09
• 公開（公告）號: CN102296112A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發明（設計）人: 王心如;夏彥愷;胡志斌;沈洪兵;吳煒
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/113;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;劉成群

發明領域

本發明屬于基因工程及生殖醫學領域，涉及人類非梗阻性無精子癥相關的精漿微小核糖核酸(microRNA，miRNA)標志物及其應用。

背景技術

不孕不育是一類常見的生殖疾病，在我國育齡夫婦中的發病率約為10％。其中有近一半與男方因素有關，由此被稱為男性不育。在所有導致男性不育病因中，精子生成障礙是最為常見的病因，也是我國成年男性生殖健康面臨的最主要威脅之一。精子生成障礙的發生是一個多因素、多階段的過程，主要臨床表現為射出精液中精子密度的降低，按WHO標準可分為少精子癥、無精子癥等(WHO定義無精子癥：顯微鏡檢未見精子的標本，經3000g離心15min，仍無精子)。目前，對于精子生成障礙程度的評估主要依靠常規的精子密度判別(人工計數或利用計算機輔助系統分析，即CASA)，尚無其他有效的手段。而常規的精子密度分析也存在以下缺點：個體精液質量波動較大，尤其易受到禁欲天數、溫度、采集精液方法等因素的影響，從而造成精子密度測量不準確；無法及時反映治療后的結果，且不易進行動態監測，對相應疾病的早期診斷效果也遠不能滿足需要；而作為男性不育的最重要表現之一的非梗阻性無精子癥，其明確診斷常需進行睪丸穿刺活檢，這給尋求生育幫助的人群帶來極大的痛苦。

盡管目前國內外研究者正努力探索非梗阻性無精子癥的新型評估和監測生物標志物，并對現有評估手段進行有效的補充，但一直難以突破傳統生物標志物發展和男性生殖實際應用中的瓶頸，即有創穿刺活檢、精液質量分析結果波動、以及早期診斷/動態監測困難。

綜上所述，由于非梗阻性無精子癥起病比較隱匿，現有診療手段還存在一些不足，發現、應用新的診斷、監測生物標志物是本領域亟待解決的問題。另外，非梗阻性無精子癥的病因還不清楚，尚缺乏有效的治療手段，大多數精子生成障礙病人只能選擇ICSI或AID等輔助生育手段，無法滿足心理上的要求，并有可能出現后代的遺傳缺陷。并且，有創傷的無精子癥確診手段可對患者的生理和心理造成影響。這都要求我們尋找到靈敏、特異、易于檢測的標志物，這些新的標志物及其指標變化也可以作為相應疾病藥物篩選、藥效評價及靶向治療的新途徑。

微小核糖核酸(microRNA，即miRNA)是近年剛剛興起的研究熱點，它是一類長約19-23個核苷酸的單鏈RNA分子，多位于基因組非編碼區，進化上高度保守，可在轉錄后水平對基因表達進行調節，并與動物的許多正常生理活動，如生物個體發育、組織分化、細胞凋亡以及能量代謝等密切相關，同時也與許多疾病的發生及發展存在著緊密的聯系。自參與調控線蟲時序發育的lin-4與let-7被發現以來，miRNA已逐漸成為調控mRNA穩定性和蛋白翻譯的研究熱點，分別在2002年和2003年兩度入選Science雜志年度十大科技突破。現在預測miRNA至少能調控5300個人類基因，也就是所有基因的30％。隨著研究的深入，越來越多的miRNA被發現。目前，miRNA與腫瘤的關系已成為研究的重點，已發現若干miRNA通過負調控基因的表達與慢性淋巴細胞性白血病、肺癌、乳腺癌、結腸癌高度相關。然而，miRNA與男性生殖尤其是精液質量的關系研究仍十分罕見，目前僅有極少量動物實驗結果，而未見人類精漿miRNA水平的研究。

最新的研究成果發現血清/血漿中存在上百種的miRNA，性質穩定、含量豐富、易于定量檢測，且存在顯著的疾病特異性，在肺癌、結腸癌中已經證實血清miRNA的表達譜可作為早期診斷的潛在生物標志物。這一發現令人振奮，血清miRNA作為一類非編碼調節性的小分子RNA有可能取代傳統的特異蛋白為代表的生物標志物，開拓了生物標志物的新境界。該研究迅速引起國際媒體的廣泛關注，路透社、合眾社、《科學的美國人》、美國《技術評論》等都對該研究成果進行了專門報道，《Nature》雜志也在其網站首頁的“最新研究進展”專欄中展示了這一最新研究進展。然而同樣作為體液的精漿還未得到相應的關注，若能發現穩定的與精子生成障礙相關的特異精漿miRNA作為生物標志物，并研發相應疾病的診斷、監測試劑盒，不僅在該領域處于國際領先地位，可創造令人矚目的經濟效益，對我國男性生殖健康也將是一次強有力的推動。

目前，對精子生成障礙程度的評估多局限于常規精液分析，易出現結果的波動，且難以早期診斷和動態監測，對于無精子癥的確診還有賴于睪丸穿刺活檢。迄今為止，還未見關于精漿miRNA用于精液質量和男性生殖功能的評價與治療方面的任何報道，尤其是精漿miRNA在人類非梗阻性無精子癥的評價與診療方面。

發明內容

本發明的目的是提供人類非梗阻性無精子癥相關的精漿microRNA標志物。