[發明專利]以Bt蛋白Bt886-cry3Aa為基礎的融合蛋白及其用途

無效

• 申請號: 201110227141.3
• 申請日: 2011-08-09
• 公開（公告）號: CN102276728A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 趙樹堂;盧孟柱;郭長花;陳敏;胡建軍;唐芳
• 申請（專利權）人: 中國林業科學研究院林業研究所
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N1/21;A01N43/36;A01N47/44;A01P7/04;C12N15/82;A01H5/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是一種以Bt蛋白Bt886-cry3Aa為基礎的融合蛋白及其用途。

背景技術

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis，簡稱Bt)是一種分布廣泛的革蘭氏陽性細菌，是一種對害蟲毒力強且對天敵無毒性的昆蟲病原微生物，對高等動物和人無毒性。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲劑，對16個目3000多種害蟲有活性。Bt在芽孢形成期可形成殺蟲晶體蛋白(Insecticidal?CrystalProteins，ICPs)，也稱δ-內毒素(delta-endotoxin)，它的形狀、結構和大小均與其毒力有著密切關系[Schnepf.E，Crickmore.N，Van?Rie.J.，Lereclus.D，Baum.J，Feitelson.J，Zeigler.D.R.，Dean.D.H.Bacillus?thuringiensis?and?its?pesticidal?crystal?proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev，1998，62(3)：775-806.]。自1981年Schnepf等克隆了Bt的第一個ICPs基因，并于1985年發表了它的DNA堿基序列及其編碼蛋白的氨基酸序列，截止目前為止已發現和克隆了四五百種ICPs基因。蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白因其殺蟲效果好、安全、高效等優點而被廣泛的應用于蟲害防治。

1996年全世界第一例轉基因抗蟲植物在美國獲準應用，它使用的基因來自Bt?cry1Ac。在接下來的幾年里，轉cry1Ab基因的抗蟲玉米，轉cry3Aa基因的抗蟲土豆等相距問世。在中國，自1998年開始正式推廣含有cry1Ac/cry1A基因的抗蟲棉以來，已經被普遍種植。在轉基因作物商業化的第一個12年(1996-2007)中，由于能得到持續穩定的收益，農民種植轉基因作物量逐年增加，給工業化國家和發展中國家的農民都帶來了經濟和環境效益。蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白在植物保護領域的應用潛力巨大，有待人們去大力開發。

Bt886-cry3Aa是目前分離出的已知對對鞘翅目害蟲有特異毒殺作用的蘇云金芽孢桿菌分泌的毒力晶體蛋白，該毒力蛋白對桑天牛有特異毒力。

桑天牛，屬鞘翅目天牛科溝脛天牛亞科。其寄主包括：桑、構、無花果、白楊、歐美楊、柳、榆、蘋果、沙果、櫻桃、梨、野海棠、柞、褚、刺槐、樹豆、楓楊、批把、油桐、花紅、柑桔等。其成蟲食害寄主嫩枝皮和葉；幼蟲于枝干的皮下和木質部內，向下蛀食，隧道內無糞屑，隔一定距離向外蛀1通氣排糞屑孔，排出大量糞屑，削弱樹勢，重者枯死。

Bt蛋白或基因的應用將是防治天牛為害林木的有效突破口。篩選分離克隆新的、高毒力的Bt基因，提高現有Bt蛋白的毒力及殺蟲活性，可以豐富殺蟲基因資源，為轉基因植物與工程菌株提供新的基因來源，可以降低害蟲對Bt毒蛋白的抗性風險，避免新的生態災難降臨，具有重要的經濟、社會和生態效益。

發明內容

本發明根據上述領域的需求，提供一種人工融合的Bt蛋白，本發明的實驗數表明該融合蛋白比野生Bt蛋白能夠在害蟲體內滯留更長時間，從而具有更高的殺蟲活性。

以Bt蛋白Bt886-cry3Aa為基礎的融合蛋白，其特征在于：所述Bt886-cry3Aa蛋白的肽鏈的至少一端融合了氨基酸序列如Seq?ID?No.1的短肽P1；

或者所述Bt886-cry3Aa蛋白的肽鏈的氨基端融合了氨基酸序列如Seq?ID?No.1的短肽P1且羧基端融合了氨基酸序列如Seq?ID?No.2所示的短肽P2。

所述融合蛋白的氨基酸序列是Seq?ID?No.3所示的氨基酸序列；或者Seq?ID?No.3所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸且具有同等蛋白活性的氨基酸序列。

所述融合蛋白的氨基酸序列是Seq?ID?No.4所示的氨基酸序列；或者Seq?ID?No.4所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸且具有同等蛋白活性的氨基酸序列。

所述融合蛋白的氨基酸序列是Seq?ID?No.5所示的氨基酸序列；或者Seq?ID?No.5所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸且具有同等蛋白活性的氨基酸序列。

編碼上述任一融合蛋白的基因。

所述基因的核苷酸序列如Seq?ID?No.6、7或8所示。

含有上述基因的重組表達載體。