[發明專利]抗水稻白背飛虱的枯草芽胞桿菌工程菌及制備方法和應用

無效

• 申請號: 201110227130.5
• 申請日: 2011-08-09
• 公開（公告）號: CN102277328A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 趙秀云;祁高富;張獻芳;張翼;王圣英
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;A01N63/00;A01P7/04;C12R1/125
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于農業微生物學技術領域，具體涉及一種水稻內生枯草芽胞桿菌，同時還涉及一種枯草芽胞桿菌工程菌的制備方法，還涉及一種抗水稻白背飛虱的枯草芽胞桿菌工程菌的用途。

背景技術

稻飛虱是我國水稻最重要的害蟲，對我國當前水稻生產已形成嚴重威脅。稻飛虱為同翅目害蟲，刺吸水稻的汁液，受害植株由于輸導組織的破壞，養分不能正常上送，影響生長和發育，造成莖稈細弱，植株矮小，籽粒不飽滿，禾苗逐漸枯萎以致死亡。此外稻飛虱通過口器刺入時產生傷口，通過傷口傳播多種病毒，而造成水稻的嚴重損失。

植物內生菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內，被感染的宿主植物不表現出外在病癥，并且可以分離到或者可以從植物組織內直接擴增出微生物DNA的方法來證明其內生。植物內生菌包括植物內生細菌、內生真菌和內生放線菌。人們發現植物體內存在大量有益的內生菌在植物體內能產生多種生物學作用，例如可以提供植物所需要的營養物質如氮源及一些激素，能夠促進植物快速生長，參與植物的防衛功能，增強植物抗逆境、抗病害、抗動物危害的的能力等。已發現內生菌對宿主植物的有益作用有：固氮作用、促生長、抗病原真菌和細菌、抗逆境、抗動物攝食及他感作用等。植物內生菌的生物多樣性決定了其產生的活性物質的多樣性。近年來人們從植物內生菌中分離到如下的活性物質：生長調節劑、抗菌活性物質、抗蟲活性物質、抗腫瘤活性物質。

凝集素是動物和植物細胞都能夠合成和分泌的、能與糖結合的蛋白質，常用的為植物凝集素(Phytoagglutin，PNA)，它是一類非免疫原的，含有1個或多個可與單糖或寡聚糖特異可逆結合的非催化結構域的植物蛋白。PNA分布廣泛，高等植物中約有14％的植物含有凝集素。人們已經從豆科、茄科、大戟科、禾本科、百合科、石蒜科、天南星科等植物中發現了1000多種PNA。目前已克隆了200多個PNA基因，對它們的性質、結構、功能進行了大量研究，發現有些凝集素對鱗翅目害蟲、鞘翅目害蟲及同翅目害蟲如蚜蟲、稻飛虱、葉蟬等刺吸式口器害蟲具有明顯的致死作用。半夏凝集素(Pinellia?ternate?agglutinin，PTA)是從三葉半夏中分離的凝集素蛋白，抗蟲實驗表明，PTA粗提液對刺吸式口器的同翅目害蟲具有明顯的抗蟲性。半夏總蛋白在1mg/ml時對褐飛虱的抑制作用達80％，見參考文獻(梁永恒，劉小川，傅強，兩種半夏蛋白及凝集素抑制褐飛虱與番茄花葉病毒初報，湖南農業科學，2007，2：93-95)。pta是一種有重要應用價值的抗蟲基因。將pta基因改造后導入其它植物體內，將PTA的抗蟲性賦予作物，目前轉pta基因植物主要有水稻、煙草、中草藥菘藍、百合等。轉基因植物雖已應用于多種農作物的品種改良中，但仍存在一些弊端，如：轉基因沉默、基因漂移、某些植物組培技術和轉基因技術難于操作，如水稻、棉花等。而用植物內生菌作為載體，構建重組菌，在植物體內表達外源蛋白，從而賦予植物新的特征是另一種較好的選擇，具有如下優點：內生菌相對植物，易于進行遺傳操作；內生菌易于發酵，進行批量生產，可大規模應用于農業生產；內生菌使用方便，操作簡單，可通過灌根、浸種等方式施用于田間；內生菌在植物體內可大量繁殖，可達到10⁶-10⁸CFU/g，有利于外源蛋白的大量表達。目前，已有多種抗性蛋白在植物內生菌中實現了表達，如蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白cry3A轉化入甘蔗內生固氮菌Gluconacetobacter?diazotrophicus，Herbaspirillum?seropedicae中，用于控制鞘翅目和鱗翅目昆蟲，見參考文獻(Salles，J.F.，Gitahy，P.M.，L.，Baldani，J.I.，2000.Use?of?endophytic?diazotrophic?bacteria?as?a?vector?to?express?the?cry3A?gene?from?Bacillus?thuringiensis.Braz.J.Microbiol.31，155-161)。

我們將有殺蟲活性的pta基因導入水稻內生菌中，以構建兼具殺蟲作用、且持效期長的內生工程菌，該重組菌將對同翅目害蟲有顯著抗性，并且由于該菌株是一類植物內生菌，在植物體內定殖后，能長期發揮功效，具有穩定、持效期長的優點，該項研究一方面順應了利用現代生物技術開發新型生物農藥的大趨勢，另一方面，也將給我國生物農藥的開發研制注入新的活力和新的競爭力。

發明內容