[發(fā)明專利]高產(chǎn)靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）Sm-128菌株及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110225762.8
• 申請日: 2011-08-08
• 公開（公告）號: CN102277323A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔣冬花;韋鳳;蔡琪敏;藍(lán)麗精;嵇豪;高愛同
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江師范大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P17/16;C12R1/43
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務(wù)所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)醫(yī)學(xué)及生活領(lǐng)域，尤其涉及一株高產(chǎn)靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia?marcescens）Sm-128菌株及其篩選方法和用途。?

背景技術(shù)

靈菌紅素（prodigiosins，PG）是一類具有三吡咯環(huán)的天然紅色素的總稱，具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗瘧疾、免疫抑制和抗腫瘤等活性。近年來，有關(guān)靈菌紅素的研究主要集中在其潛在的臨床應(yīng)用方面，靈菌紅素是一種很有發(fā)展?jié)摿Φ目鼓[瘤藥物，其平均IC50（半抑制濃度）為2.1?μmol/L時對人體57種不同癌細(xì)胞均具有較強的抗性，對體外肝癌轉(zhuǎn)移和人原發(fā)癌細(xì)胞等多種人類癌細(xì)胞也有抗性，且對非惡性細(xì)胞系沒有明顯的毒性。?

靈菌紅素作為次生代謝產(chǎn)物，可以由多種微生物代謝產(chǎn)生，其產(chǎn)生菌主要有粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia?marcescens）、放線菌和其他一些細(xì)菌，國內(nèi)采集于大亞灣的海洋假單孢細(xì)菌（Pseudomonas?sp.）中也可分離得到靈菌紅素和其衍生物二甲基靈菌紅素，其中以沙雷氏菌屬（Serratia）合成靈菌紅素的報道居多。?

靈菌紅素具有較強的藥理活性，但由于靈菌紅素難以化學(xué)合成，而利用微生物合成時往往產(chǎn)率較低，使得其藥理機(jī)制，藥理功效以及毒副作用等方面問題都懸而未決，限制了靈菌紅素的應(yīng)用，但靈菌紅素是一種極具特色的抗癌備選藥物。微生物發(fā)酵生產(chǎn)的?PG?是比較理想的天然色素，其產(chǎn)生的色素可直接用于工業(yè)、制藥業(yè)等，具有很好的市場潛力，因此對產(chǎn)靈菌紅素菌種的開發(fā)及發(fā)酵生產(chǎn)工藝條件的研究具有非常重要的意義。?

目前國內(nèi)對靈菌紅素的發(fā)酵生產(chǎn)工藝研究較少，尚處于探索階段，國內(nèi)已有文獻(xiàn)報道的產(chǎn)靈菌紅素菌株的產(chǎn)量均處于較低水平，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。?

發(fā)明內(nèi)容

針對市場上對靈菌紅素需求的日益增長，而目前高產(chǎn)靈菌紅素菌株缺乏、發(fā)酵生產(chǎn)工藝不完善等問題。本發(fā)明的一個目的是提供一株從魚體中篩選到的高產(chǎn)靈菌紅素Sm-128菌株。本發(fā)明的另外一個目的是提供采用上述的靈菌紅素Sm-128菌株生產(chǎn)靈菌紅素的方法。?

為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：?

高產(chǎn)靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia?marcescens）Sm-128菌株，該菌株已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC?NO：M2010347，保藏時間為：2010年12月13日。

本發(fā)明所述菌株篩選自淡水魚體。篩選方法如下：取一淡水鯽魚，以無菌水浸泡洗滌，解剖魚體，得表層鱗片、肌肉組織和內(nèi)臟。分別用無菌水密閉條件下低溫浸泡過夜，采用濃度梯度稀釋法，將稀釋液涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，28?℃下恒溫培養(yǎng)。挑取早期菌落為白色，后期為紅色或紫紅色的單菌落，連續(xù)劃線分離純化，得性狀單一的Sm-128菌株。本發(fā)明從淡水魚體中分離獲得的粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia?marcescens）具有生長條件粗放、營養(yǎng)要求簡單、代謝快、生長周期短、生產(chǎn)色素能力強、性狀穩(wěn)定等特征，可為工業(yè)化生產(chǎn)靈菌紅素提供菌種資源。?

為了實現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：?

一種高產(chǎn)靈菌紅素的生產(chǎn)方法，該方法包括以下的步驟：

1）取粘質(zhì)沙雷氏菌Sm-128保藏菌種，在無菌條件下，挑取少許菌種轉(zhuǎn)接到活化培養(yǎng)基上；

2）活化培養(yǎng)后，進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng)；

3）最后在培養(yǎng)液及菌體中獲得目的產(chǎn)物靈菌紅素。

作為優(yōu)選，上述步驟3）中發(fā)酵培養(yǎng)基為蛋白胨9?g/L，甘油10?ml/L，pH?7.4；發(fā)酵條件為裝液量36?mL/250?mL，轉(zhuǎn)速180?r/m，接種量6?%，溫度28?℃，發(fā)酵時間65?h。?

作為優(yōu)選，上述步驟3）中發(fā)酵液離心洗滌后得菌體，以無水乙醇配制成20%～40%菌懸液，通過高壓勻漿破碎后以乙酸乙酯反復(fù)浸提直至菌體無色為止；將乙酸乙酯相合并濃縮，得色素粗品。?

作為再優(yōu)選，上述色素粗品用乙醇復(fù)溶，以正己烷:乙酸乙酯=1:30～1：50作為洗脫劑進(jìn)行柱層析，得到一橙色組分a1，將a1蒸干用甲醇復(fù)溶，過LH-20凝膠柱，得純品。?