[發(fā)明專(zhuān)利]一種促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的新型shRNA及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110224992.2
• 申請(qǐng)日: 2011-08-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102321669A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 苗向陽(yáng)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/867
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/867;C12N15/113;C12N7/01;A01K67/027
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• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種新型shRNA的構(gòu)建。具體而言，本發(fā)明針對(duì)綿羊肌肉生長(zhǎng)抑制素基因MSTN的核苷酸序列設(shè)計(jì)合成shRNA單鏈寡核苷酸，構(gòu)建了shRNA慢病毒干擾載體，得到了具有良好應(yīng)用前景的新型shRNA。

背景技術(shù)

肌肉是動(dòng)物胴體的重要組成部分，是畜牧生產(chǎn)中的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一。為此，科學(xué)界在對(duì)增加肌肉量、提高肌肉品質(zhì)等方面的探索從未停止過(guò)。首先被用來(lái)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的是生長(zhǎng)激素(GH)基因，其次還有生長(zhǎng)激素調(diào)節(jié)軸上的相關(guān)基因，比如生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)基因和類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子(IGF-1)基因等。總體上說(shuō)，這類(lèi)激素基因能夠刺激動(dòng)物生長(zhǎng)，增加瘦肉量和提高飼料轉(zhuǎn)化率，但會(huì)引起各種副作用，也沒(méi)有產(chǎn)生理想的表型性狀。

1997年美國(guó)霍普金斯大學(xué)的Mcpherron等[McPherron，A.C.，Lawler，A.M.&Lee，S.J.Regulation?of?skeletal?muscle?mass?in?mice?by?a?new?TGF-beta?superfamily?member.Nature?1997；387，83-90]利用簡(jiǎn)并引物在小鼠身上偶然發(fā)現(xiàn)了myostatin基因，經(jīng)蛋白質(zhì)同源分析和核酸序列比對(duì)，證明其屬于TGF-β(transforming?growthfactorβ)超家族成員，故又稱(chēng)GDF-8(growth?differentiation?factor?8)。該家族成員在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和維持組織穩(wěn)態(tài)及調(diào)控骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育方面均發(fā)揮著重要的作用，另外通過(guò)對(duì)非雙肌牛myostatin基因的分析表明，該基因的突變是造成雙肌現(xiàn)象的重要的原因之一。2001年，由Michel?Georges領(lǐng)導(dǎo)的研究小組，歷經(jīng)十余年的研究發(fā)現(xiàn)比利時(shí)藍(lán)牛(Belginm?Blue)的雙肌性狀是由于肌肉生長(zhǎng)抑制素基因突變?cè)斐傻腫Hughes?SM.Running?without?regulators.Nature，1992，360：536-537.]。與此同時(shí)，由美國(guó)農(nóng)業(yè)部的Tim?Smith領(lǐng)導(dǎo)的研究小組和由霍普金斯大學(xué)的Sejin?Lee領(lǐng)導(dǎo)的研究小組也發(fā)現(xiàn)比利時(shí)藍(lán)牛及皮爾蒙特牛(Piedmontese)的雙肌性狀是肌肉生長(zhǎng)抑制素基因突變?cè)斐傻腫Jeanplong?F，Sharma?M，Somers?W?G，et?a.l?Genomic?organization?and?neonatal?expression?of?the?bovine?myostatin?gene.Molecular?and?Cellular?Biochemistry，2001，200：31-37.]。通過(guò)基因敲除，反義核酸及體內(nèi)表達(dá)肌肉生長(zhǎng)抑制素基因拮抗因子的實(shí)驗(yàn)，證明肌肉生長(zhǎng)抑制素基因是限制肌肉超常發(fā)育的負(fù)調(diào)控基因。MSTN的活性降低或喪失，使得肌肉與其他組織的比例大大提高，因此在畜牧生產(chǎn)上有良好的應(yīng)用前景。這在脂肪比例較大的家畜中應(yīng)用潛力很大。

1998年Fire等發(fā)現(xiàn)雙鏈短RNA(dsRNA)序列與靶基因外顯子互補(bǔ)時(shí)，基因的表達(dá)受到抑制，而與啟動(dòng)子和內(nèi)含子互補(bǔ)時(shí)不能引起基因沉默，于是將這種由dsRNA基因沉默現(xiàn)象稱(chēng)為RNAi。RNAi的作用多是在轉(zhuǎn)錄后的水平實(shí)現(xiàn)其基因“剔除”效應(yīng)的。具體的過(guò)程可以分為三個(gè)階段：①起始階段：外源性的dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后在Dicer酶的作用下被剪切成21-23nt且?guī)в?’端單鏈尾巴及磷酸化5’端的siRNA。②效應(yīng)階段：siRNA解鏈成單鏈與Dicer結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA?induced?silencing?complex，RISC)，活化的RISC在siRNA引導(dǎo)下通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶mRNA結(jié)合，接著內(nèi)切核酸酶將mRNA切割成21-23nt的片段，特異性的抑制靶基因的表達(dá)。③擴(kuò)增階段：在RNA依賴(lài)的RNA聚合酶(RNA-dependent?RNA?polymerase，RdRPs)的作用下，以siRNA為引物，mRNA為模版，合成更多的dsRNA，進(jìn)一步放大這種特定的降解靶mRNA的作用，使基因表達(dá)持續(xù)受到抑制。siRNA還可以在RNA依賴(lài)的RNA聚合酶的作用下大量擴(kuò)增并轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，使RNAi擴(kuò)散到整個(gè)機(jī)體并傳代。