[發(fā)明專利]胃癌靶向STAT3基因的siRNAs表達(dá)載體的構(gòu)建、篩選及其用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110224323.5
• 申請(qǐng)日: 2011-08-05
• 公開（公告）號(hào): CN102304538A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖東杰;郟雁飛;鄭燕;童書青;馬曉麗;汪運(yùn)山
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 汪運(yùn)山
• 主分類號(hào): C12N15/63
• 分類號(hào): C12N15/63;C12N15/113;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219
• 代理人: 苗奎

1.靶向STAT3基因的siRNAs表達(dá)載體，其特征是，以pGPU6/GFP/Neo?siRNA?ExpressionVector為載體，針對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)編碼區(qū)上、中游的兩段序列，在較高表達(dá)STAT3的胃癌細(xì)胞系HGC-27中發(fā)揮RNA干擾作用；這兩段STAT3特異性RNA干涉靶序列分別為：①5’-GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3’，起始于956位；②5’-GCGTCCAGTTCACTACTAAAG-3’，起始于1243位，是用于STAT3基因相關(guān)性胃癌的治療性物質(zhì)，由以下方法制得：

(1)RNA干涉靶序列的選擇及插入序列的設(shè)計(jì)與合成

選擇STAT3基因編碼區(qū)的兩段序列①5’-GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3’②5’-GCGTCCAGTTCACTACTAAAG-3’，設(shè)計(jì)并分別體外合成兩對(duì)互補(bǔ)的寡核苷酸序列，序列如下：

①STAT3寡核苷酸序列1：

正義鏈：

5’-CACCGCAACAGATTGCCTGCATTGGTTCAAGAGACCAATGCAGGCAATCTGTTGCTTTTTTG-3’

反義鏈：

5’-GATCCAAAAAAGCAACAGATTGCCTGCATTGGTCTCTTGAACCAATGCAGGCAATCTGTTGC-3’

②STAT3寡核苷酸序列2：

正義鏈：

5’-CACCGCGTCCAGTTCACTACTAAAGTTCAAGAGACTTTAGTAGTGAACTGGACGCTTTTTTG-3’

反義鏈：

5’-GATCCAAAAAAGCGTCCAGTTCACTACTAAAGTCTCTTGAACTTTAGTAGTGAACTGGACGC-3’

(2)合成的寡核苷酸分別與線性載體pGPU6/GFP/Neo?siRNA?Expression?Vector連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增及質(zhì)粒的提取

將步驟(1)合成的兩對(duì)寡核苷酸等量混勻，95℃作用3分鐘后緩慢冷卻至室溫，然后將結(jié)合的雙鏈寡核苷酸與線性化的pGPU6/GFP/Neo?siRNA?Expression?Vector質(zhì)粒載體連接，最后轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌，經(jīng)卡那霉素篩選，挑選單個(gè)菌落大量培養(yǎng)；用質(zhì)粒提取試劑盒提取純化質(zhì)粒DNA；

(3)質(zhì)粒的鑒定

將步驟(2)提取的質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度計(jì)分析測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度和純度，并進(jìn)行插入片斷測(cè)序，以確定合成的寡核苷酸是否已正確轉(zhuǎn)入pGPU6/GFP/Neo?siRNAExpression?Vector質(zhì)粒中。

2.權(quán)利要求1的靶向STAT3基因的siRNAs表達(dá)載體在制備治療表達(dá)STAT3的胃癌的基因藥物中的應(yīng)用。