[發明專利]一種菲牛蛭藥材指紋圖譜的測定方法

有效

• 申請號: 201110224102.8
• 申請日: 2011-08-06
• 公開（公告）號: CN102914612A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 孟作環;馬振嗣;喬莉;李文烈;賈繼明;宋劍
• 申請（專利權）人: 河北以嶺醫藥研究院有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種菲牛蛭藥材指紋圖譜的測定方法，屬于藥物分析技術領域。

背景技術

菲牛蛭(Poecilobdella?manillensis)，俗稱金邊螞蝗，隸屬于無吻蛭目、醫蛭科、牛蛭屬，主要分布于廣西、廣東、海南和福建等省區,并且可以進行人工養殖，其具有顯著的抗凝血、抗血栓、溶栓、抗血小板聚集活性，主要化學成分為脂肪酸、氨基酸和蛋白質，其中以報道的活性成分為水蛭素P6、水蛭素P18、菲牛蛭素A和菲牛蛭素B，急性毒性試驗表明菲牛蛭沒有明顯的毒副作用，因此其具有顯著的藥用價值，迄今為止藥典和地方標準均無收載，也無任何關于指紋圖譜的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種菲牛蛭指紋圖譜的測定方法。

本發明所述指紋圖譜的測定方法是采用高效液相色譜法測定菲牛蛭的指紋圖譜。

本發明所述指紋圖譜的測定方法供試液配制方法及色譜條件優選為：

供試液配制方法：菲牛蛭藥材干品粉碎，過40目篩，取0.40g，加5ml去離子水超聲15min，4500r·min^-1離心15min，用0.45μm濾膜濾過，濾液作為高效液相色譜供試品溶液備用；

色譜條件：色譜柱為C18柱,規格為250mm×4.6mm,5μm；流動相：A相為乙腈，B相為水,梯度洗脫；洗脫程序為0→5min，A為0%，5→23min，A為0%→4%，23→24min，A為4%→5%，24-66min，A為5%→21.4%；流速：1ml·min^-1；柱溫：20℃；檢測波長為254nm。

為證實該方法準確可靠，重復性好，能夠用于控制菲牛蛭藥材的內在質量進行如下方法學驗證：

1儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀(2695-2996，美國Waters公司)；電子天平(AG135，MettlerToledo)；KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀有限公司)；高速萬能粉碎機（天津市太斯特儀器有限公司）；相似度計算軟件：中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版。

乙腈為色譜純（Fisherscientific)；實驗用水為超純水。

菲牛蛭由廣西科康生物科技有限公司提供，批號為：200901、200902、200903、201001、201002、201003、201104、201101、201102，201103。

2方法與結果

2.1供試品溶液制備

供試液配制方法：菲牛蛭藥材干品粉碎，過40目篩，取0.40g，加5ml去離子水超聲15min，4500r·min^-1離心15min，用0.45μm濾膜濾過，濾液作為高效液相色譜供試品溶液備用；

2.2液相色譜條件

色譜柱為C18柱,規格為250mm×4.6mm,5μm；流動相：A相為乙腈，B相為水,梯度洗脫；洗脫程序為0→5min，A為0%，5→23min，A為0%→4%，23→24min，A為4%→5%，24-66min，A為5%→21.4%；流速：1ml·min^-1；柱溫：20℃；檢測波長為254nm。

2.3方法學考察

2.3.1精密度試驗

取同一批號供試品溶液，連續進樣5次，測得各共有峰相對保留時間和峰面積RSD均小于3%，表明進樣的精密度良好。

2.3.2穩定性試驗

取同一批號供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進樣，測得各共有峰相對保留時間和峰面積RSD均小于3%，表明供試品溶液在24h內穩定。

2.3.3重復性試驗

取同一批號供試品，按2.2項方法，分別制備5份供試品溶液，分別進樣，測得各共有峰相對保留時間和峰面積RSD均小于3%，表明方法重復性較好。

2.3.4菲牛蛭藥材特征指紋圖譜及溶劑的測定圖譜，見圖1和圖2，由圖可見，溶劑對樣品測定無干擾。按上述方法檢測10批樣品指紋圖譜,同時生成對照分峰，標示了指紋圖譜中23個共有峰，其中6、7、8、13、14、16，17和21號的峰為強吸收峰。

指紋圖譜的建立及相似度分析

2.4.1指紋圖譜的建立

取10批菲牛蛭藥材樣品，菲牛蛭藥材指紋圖譜共有模式確立利用中國藥典“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版”，將1-10批次菲牛蛭藥材圖譜數據導入，經數據自動匹配，以中位數法生成對照指紋圖譜，指紋圖譜見圖3。

指紋圖譜相似度分析