[發(fā)明專利]一種抑制移植器官慢性排斥反應(yīng)的抗體的制備及純化方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110223524.3
• 申請(qǐng)日: 2011-08-05
• 公開（公告）號(hào): CN102911270A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹利平;丁國(guó)平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/18
• 分類號(hào): C07K16/18;C07K1/20
• 代理公司: 杭州裕陽(yáng)專利事務(wù)所(普通合伙) 33221
• 代理人: 冉國(guó)政

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種抑制移植器官慢性排斥反應(yīng)的抗體的制備及純化方法。?

背景技術(shù)

自上世紀(jì)50年代美國(guó)成功實(shí)施世界上首例腎移植以來，器官移植作為一項(xiàng)劃時(shí)代的新技術(shù)在過去的50多年中得到了蓬勃發(fā)展，特別是隨著八十年代末免疫抑制劑的出現(xiàn)，更是極大地提高了器官移植的成功率和受者的存活率，至今全球大約已經(jīng)有60多萬(wàn)患者接受了包括腎、肝、心在內(nèi)的器官移植手術(shù)。我國(guó)從上世紀(jì)60年代開展器官移植以來，至2006年全國(guó)年器官移植數(shù)已位居全球第二位，取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步和發(fā)展。移植物發(fā)生免疫排斥反應(yīng)是自器官移植出現(xiàn)后就一直困擾著國(guó)內(nèi)外學(xué)者的最大瓶頸，雖然移植免疫機(jī)制的研究在不斷深入，大量新免疫抑制藥物在不斷涌現(xiàn)，但是不可否認(rèn)目前國(guó)內(nèi)外依然面臨著如：移植后移植物發(fā)生免疫排斥機(jī)率仍然較高，免疫抑制劑費(fèi)用昂貴及長(zhǎng)期應(yīng)用后發(fā)生腫瘤、感染的機(jī)會(huì)大大增加等諸多問題。?

多年來的移植免疫研究表明，移植成功與否的關(guān)鍵取決于供、受者間組織相容性抗原是否一致或相近。一直以來，學(xué)界都將研究重點(diǎn)放在了經(jīng)典的主要組織相容性復(fù)合體(major?histocompability?complex，MHC)，即MHC-I和MHC-II上，并建立了經(jīng)典的免疫排斥理論：即同種異基因個(gè)體間移植后，受者T細(xì)胞通過直接或間接兩條途徑，在協(xié)同刺激因子的作用下獲得激活，從而發(fā)動(dòng)一系列免疫應(yīng)答，且認(rèn)為體液免疫是超急性排斥反應(yīng)和加速急性排斥反應(yīng)的主導(dǎo)機(jī)制；而急性排斥反應(yīng)和慢性排斥反應(yīng)主要由細(xì)胞免疫反應(yīng)機(jī)制參與。因此以往在同種異體器官移植前往往需要進(jìn)行供受體間的經(jīng)典MHC交叉配型（主要是HLA-A，HLA-B和HLA-DR）試驗(yàn)，國(guó)內(nèi)外的臨床實(shí)驗(yàn)也證明了移植前經(jīng)典MHC交叉配型陰性的受者和交叉配型陽(yáng)性的受者相比，前者在移植物免疫排斥發(fā)生率上明顯低于后者。但是后來有研究人員發(fā)現(xiàn)一些即使是經(jīng)典MHC交叉配型一致的受者在移植后，也不能完全避免急性或慢性免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，并且在一些腎移植前的受者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了抗同種異型HLA抗體(IgG、IgM)?[2,3]，提示這些抗體可能在移植腎免疫排斥發(fā)生機(jī)制中起重要作用。有學(xué)者據(jù)此提出了體液學(xué)說，即急性或慢性移植免疫排斥反應(yīng)可能由受者體內(nèi)存在的供體特異性的同種異型抗原抗體所介導(dǎo)，認(rèn)為以供體特異性抗體與供體移植物抗原結(jié)合作為最初的觸發(fā)點(diǎn)，引起了一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)最后導(dǎo)致移植物損傷、失去功能。在一些發(fā)生急性或慢性排斥反應(yīng)的移植腎的病理檢查中發(fā)現(xiàn)C4d的沉積恰好部分論證了該學(xué)說。有意思的是，在另外一些術(shù)前同樣經(jīng)過經(jīng)典HLA交叉配型，且抗HLA抗體檢測(cè)陰性卻依然發(fā)生了急性或慢性排斥反應(yīng)的受體體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)了大量激活的NK細(xì)胞和T細(xì)胞，說明細(xì)胞免疫反應(yīng)機(jī)制的存在。?

近來美國(guó)學(xué)者在一些腎移植術(shù)前和術(shù)后患者的血清中均發(fā)現(xiàn)了抗MICA蛋白抗體，隨后又在出現(xiàn)排斥反應(yīng)被切除的移植腎中發(fā)現(xiàn)了更高滴度的該抗體，提示此類患者在腎移植前體內(nèi)存在同種異型MICA抗原的預(yù)致敏，且抗MICA蛋白抗體在腎移植后發(fā)生的排斥反應(yīng)中可能起著重要作用。但目前國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)有針對(duì)MICA抑制器官移植術(shù)后慢性排斥反應(yīng)的方法存在。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于MICA移植免疫的研究仍然存在一些空白點(diǎn)：①在封閉移植物經(jīng)典MHC分子的條件下，仍然有部分移植物發(fā)生了急慢性排斥反應(yīng)，表明有其它尚未知曉的因素引起或參與了該反應(yīng)，而MICA可能是其中比較重要的因素之一。②雖然在一些腎移植前后體內(nèi)及發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的臟器灌洗液中均發(fā)現(xiàn)了抗MICA抗體，但關(guān)于MICA參與的移植免疫排斥反應(yīng)機(jī)制仍然不清楚，且目前大多研究主要集中在腎移植的細(xì)胞和分子水平，缺少其他器官如肝移植和大型動(dòng)物的體內(nèi)模型研究；③國(guó)內(nèi)外研究者在腎移植患者發(fā)生急性或慢性排斥后切除的腎臟病理切片中發(fā)現(xiàn)了大量的C4d的沉積，說明存在經(jīng)典的補(bǔ)體激活，即意味著體液免疫反應(yīng)的出現(xiàn)，這表明以往細(xì)胞免疫機(jī)制介導(dǎo)急慢性排斥反應(yīng)的單控移植免疫機(jī)制存在缺陷。?

發(fā)明內(nèi)容

為了克服因MICA過表達(dá)引起器官移植后慢性排斥反應(yīng)的問題，本發(fā)明提供一種抑制移植器官慢性排斥反應(yīng)的抗體的制備及純化方法，使用本發(fā)明所述的制備及純化方法所得到的抗MICA抗體，能夠通過封閉內(nèi)源性MICA蛋白、MICA　siRNA?抑制內(nèi)源性MICA基因表達(dá)，從而達(dá)到阻斷移植器官M(fèi)ICA表達(dá)的效果。?

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案：?

本發(fā)明一種抑制移植器官慢性排斥反應(yīng)的抗體的制備及純化方法，包括以下步驟：

步驟一：

用淋巴細(xì)胞分離液收集外周血單核細(xì)胞，體外培養(yǎng)擴(kuò)增，20ng/ml?rMICA誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集培養(yǎng)細(xì)胞；