[發明專利]表達大腸桿菌毒素蛋白mazF基因的表達盒mazF-cassette及其構建法和用途

有效

• 申請號: 201110223046.6
• 申請日: 2011-08-05
• 公開（公告）號: CN102311970A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發明（設計）人: 李衛芬;林志偉;余東游;吳兵兵;徐歆;鄧斌
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/66;C12R1/19;C12R1/125
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.表達大腸桿菌毒素蛋白mazF基因的表達盒mazF-cassette，其特征是：其核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1。

2.根據權利要求1所述的表達大腸桿菌毒素蛋白mazF基因的表達盒mazF-cassette，其特征是：該表達盒包含了抗性基因zeocin、木糖誘導的啟動子PxylA和mazF基因，該表達盒DNA片段為936bp。

3.如權利要求1或2所述的表達大腸桿菌毒素蛋白mazF基因的表達盒mazF-cassette的構建方法，其特征是依次包括以下步驟：

1)、擴增大腸桿菌毒素蛋白mazF基因；

2)、擴增木糖誘導的啟動子PxylA基因；

3)、擴增抗性基因zeocm；

4)、將上述三個PCR片段，通過重疊延伸聚合酶鏈反應的方法，融合成一個重組PCR片段；

5)、將所述重組PCR片段，用限制性內切酶Sal?I/Xba?I進行酶切，與同樣酶切的整合載體pSG1729相連，轉化枯草芽孢桿菌1A751，所得到轉化子為含有該表達盒的宿主菌。

4.如權利要求1或2所述的表達大腸桿菌毒素蛋白mazF基因的表達盒mazF-cassette的用途，其特征是：用于構建枯草桿菌通用無標記同源重組系統。

5.根據權利要求4所述的表達大腸桿菌毒素蛋白mazF基因的表達盒mazF-cassette的用途，其特征是：首先構建二側含有枯草芽孢桿菌淀粉酶基因(amyE)基因的刪除重組PCR片段的表達盒，然后將該表達盒轉入枯草芽孢桿菌1A751中，從而實現無標記的枯草芽孢桿菌淀粉酶基因(amyE)基因的刪除。

6.根據權利要求4所述的表達大腸桿菌毒素蛋白mazF基因的表達盒mazF-cassette的用途，其特征是：首先構建枯草芽孢桿菌淀粉酶基因(amyE)基因位點引入綠色熒光蛋白表達盒的重組PCR片段，然后將該重組表達盒轉入枯草芽孢桿菌1A751中，從而實現綠色熒光蛋白表達盒的引入，而未留下其它抗生素基因。

7.根據權利要求4所述的表達大腸桿菌毒素蛋白mazF基因的表達盒mazF-cassette的用途，其特征是：首先構建含有Skin基因簇((spoIVCB-spoIIIC)+Δpro7(yrkM-yraK))的刪除重組PCR片段的表達盒；然后將該表達盒轉入枯草芽孢桿菌1A751中，從而實現一個長達97kb的Skin基因簇的刪除，而未留下其它抗生素基因。

8.如權利要求1或2所述的表達大腸桿菌毒素蛋白mazF基因的表達盒mazF-cassette的用途，其特征是：該表達盒可適用于含有阻遏蛋白XylR的原核微生物，適合于其它構建芽孢桿菌屬或其它原核微生物的通用無標記同源重組系統。