[發(fā)明專利]重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白在制備治療化療藥所致白細(xì)胞減少癥藥物中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110222012.5
• 申請日: 2008-01-03
• 公開（公告）號: CN102274487A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫非;劉立俠;許守民;梁重陽
• 申請（專利權(quán)）人: 張喜田
• 主分類號: A61K38/16
• 分類號: A61K38/16;A61P7/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本申請是“具有抗腫瘤作用的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其藥物制劑”申請的分案申請。其原申請的申請日是2008年1月3日，申請?zhí)柺?00810050206.x，原發(fā)明的名稱是“具有抗腫瘤作用的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其藥物制劑”。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域，涉及使用巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)表達(dá)的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的抗腫瘤用途及其抗腫瘤藥物制劑。

背景技術(shù)

靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(Immunoregulatory?Protein?of?Ganoderma?lucidium)，由日本Kino等人1989年從赤靈芝菌絲體提取物中分離和純化的小分子蛋白質(zhì)(Kohsuke?Kino?et?al.，J.Boil.Chem.1989，1：472-478)，命名為LZ-8，并測定其氨基酸順序和免疫生理活性。蛋白質(zhì)測序表明LZ-8由110個氨基酸殘基組成，氨基端乙酰化，分子量為12.4KD，等電點為4.4。靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的主要功能在于它可以促進(jìn)末梢淋巴細(xì)胞和脾臟細(xì)胞的增生，誘導(dǎo)動物和人體的巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素，腫瘤壞死因子和干擾素等)，進(jìn)而防御及消除病原體的侵害，維護(hù)機(jī)體的健康，實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)功能。

很多研究表明，LZ-8發(fā)揮抗腫瘤作用主要是通過免疫調(diào)節(jié)途徑實現(xiàn)。但本發(fā)明的積極效果在于首次公開了重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(Recombinant?Immunoregulatory?Protein?of?Ganoderma?Lucidium，rLZ-8)通過與腫瘤細(xì)胞膜特異結(jié)合誘導(dǎo)其凋亡來直接殺傷或殺死腫瘤細(xì)胞而發(fā)揮抗腫瘤的用途。在發(fā)揮作用的同時，不同于化療藥物會降低白細(xì)胞，rLZ-8會維持和升高白細(xì)胞，且不影響正常細(xì)胞的作用。

惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，目前尚無特別有效的防治策略。近年來，隨著分子腫瘤學(xué)、分子藥理學(xué)的不斷發(fā)展，以及對腫瘤本質(zhì)的闡明，大規(guī)模、快速篩選組合化學(xué)、基因工程等先進(jìn)技術(shù)的發(fā)明和應(yīng)用加速了藥物開發(fā)進(jìn)程。用不同方法啟動或激活腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制，影響細(xì)胞不同基因表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，減少對正常細(xì)胞的影響和放化療帶來的副作用，已成為目前腫瘤治療的重要策略。

本發(fā)明的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白不僅在體外能快速高效誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，而且在小鼠腫瘤模型體內(nèi)也能有效殺死腫瘤細(xì)胞，且無明顯毒副作用，并能保持或升高白細(xì)胞的水平，對應(yīng)用重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白研制抗腫瘤藥物有一定的積極作用。

發(fā)明內(nèi)容

1.公開了rLZ-8抗腫瘤作用及升高白細(xì)胞作用。

2.殺傷白血病細(xì)胞的藥效學(xué)和細(xì)胞凋亡實驗，藥效學(xué)實驗表明rLZ-8對白血病細(xì)胞NB4、K562和HL-60具有很強(qiáng)殺傷作用，流式細(xì)胞儀進(jìn)行的細(xì)胞凋亡檢測進(jìn)一步證明了rLZ-8誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡。

3.溶血實驗、大鼠骨髓像實驗和促紅細(xì)胞凝聚實驗證實其對正常細(xì)胞沒有影響。

4.荷瘤小鼠實驗表明，rLZ-8可以抑制小鼠艾氏腹水瘤S180和移植性肝癌細(xì)胞H22在體內(nèi)生長。

5.蛋白熒光標(biāo)記實驗表明，rLZ-8可以通過與腫瘤細(xì)胞膜特異結(jié)合誘導(dǎo)其凋亡而殺傷或殺死腫瘤細(xì)胞。

6.rLZ-8藥物制劑的核心成分含有重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白和任選的藥學(xué)可接受的輔劑。

7.rLZ-8藥物制劑可以通過口服和非腸道給藥。

說明書附圖說明：

圖1rLZ-8對NB4腫瘤細(xì)胞體外殺傷結(jié)果

圖2rLZ-8對K562腫瘤細(xì)胞體外殺傷結(jié)果

圖3rLZ-8誘導(dǎo)K562和NB4細(xì)胞凋亡PI單染檢測結(jié)果

圖4rLZ-8誘導(dǎo)K562和HL-60細(xì)胞凋亡Annexin?V/PI雙染檢測結(jié)果

圖5用流式細(xì)胞儀檢測NB4細(xì)胞發(fā)生凋亡時線粒體膜電位的變化

圖6接種S180艾氏腹水瘤細(xì)胞小鼠體重變化(橫軸為時間(d)；縱軸為平均體重(g)；曲線符號-◆-代表S180組；-■-代表S180+rLZ-8組；-▲-代表CK組)

圖7接種H22移植性腫瘤細(xì)胞小鼠體重變化((橫軸為時間(d)；縱軸為平均體重(g)；曲線符號-◆-代表H22組；-■-代表H22+rLZ-8組；-▲-代表CK組))

圖8FITC-rLZ-8(100ng.ml-1)對大鼠心肌組織的標(biāo)記(暗、明場)

圖9FITC-rLZ-8(100ng.ml-1)對兔軟骨細(xì)胞的標(biāo)記(暗、明場)

圖10FITC-rLZ-8(100ng.ml-1)對HL-60細(xì)胞的標(biāo)記(暗、明場)