[發明專利]有機磷農藥多殘留的免疫檢測方法

無效

• 申請號: 201110219714.8
• 申請日: 2011-08-02
• 公開（公告）號: CN102411051A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 朱鴻林;沈國清;胡寅;姜官鑫
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/52;C07K14/765;C07K16/44;H01F1/11;B82Y25/00;B82Y40/00
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中

技術領域

本發明涉及一種農藥檢測技術領域的方法，具體涉及一種有機磷農藥多殘留的免疫檢測方法。

背景技術

有機磷殺蟲劑以其殺蟲譜廣、殘效期較短、價格低廉而被廣泛應用，農藥使用不當，使得有機磷農藥殘留成為我國食品中農藥殘留的重要問題。目前，對該類農藥的檢測方法主要有氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、毛細管電泳法（CE）等，這些檢測技術相對成熟，靈敏度高，但是需要昂貴的儀器、測試時間長且需要專業的技術人員，不適合大規模、快速化的檢測。近年來，各國都在研究快速的有機磷多殘留檢測方法，目前應用最廣的是酶聯免疫分析方法，利用抗原與抗體反應的特異性，酶催化的高效與方法作用，使得其成為一種新型快速檢測方法。

磁性納米粒子是近年來發展起來的一種新型材料，由于其具有超順磁性、大比表面積以及良好的生物相容性等特性而被廣泛地應用在生物、醫學等領域，目前研究和應用最多的是Fe₃O₄等鐵的氧化物。免疫磁珠合成技術，是指利用共沉淀法制備Fe₃O₄并以此作為核，通過在核的表面修飾不同的功能化基團如：-OH、-COOH、-NH₂等，使其與某些生物活性物質結合（如抗原、抗體、酶等）形成新的復合物。合成的免疫磁珠不但具有磁性，容易在外磁場的作用下分離，而且具有生物活性，可廣泛應用于細胞分離和提純、免疫檢測、核酸分析和基因工程、作為靶向釋藥的載體等領域。

基于磁性納米粒子的試紙條檢測技術指將免疫磁珠應用到傳統的試紙條檢測中，以纖維素膜為載體，將有機磷通用抗原包被在膜上，封閉后分別滴加樣品和免疫磁珠，最后通過膜上的顏色來判斷實驗結果，實現定性和半定量檢測目的。

經檢索文獻發現，中國專利《快速檢測有機磷農藥殘留的魚酯酶試劑（公開號：CN1396267）》、《殘留有機磷農藥快速測試盒及制造方法（公開號：CN1293363）》、《一種能檢測各種農產品中有機磷和氨基甲酸酯農藥殘留的速測卡（公開號：CN101140236）》、《一種檢測有機磷農藥殘留試紙的制備及其使用方法（公開號：CN101299029）》，其原理均基于有機磷農藥對動植物體內的某些酶有抑制作用，通過酶的底物的水解程度（顯色程度）來判斷有機磷農藥的殘留程度，這些方法的不足之處在于：1、容易出現假陽性現象，檢測特異性不強；2、提取生物酶的過程相對繁瑣，且生物酶易受溫度等因素的影響。專利文獻《一種檢測有機磷農藥的免疫膠體金測試條及其制備方法（公開號：CN101042405）》中披露的技術方案提高了檢測特異性，但是試紙條制備步驟仍然很復雜，且只能定性的通過顏色深淺來判斷結果。

發明內容

本發明的目的是針對目前傳統有機磷農藥多殘留檢測中存在的不足，提供一種有機

磷農藥多殘留的免疫檢測方法。本檢測方法操作簡便、靈敏、快速、不需要大型儀器，適合現場抽樣檢測以及大批量的檢測任務。

為實現上述目的，本發明通過以下技術方案實現，本發明的有機磷農藥多殘留的免疫檢測方法包括如下步驟：

步驟一，設計及合成有機磷通用半抗原，并與蛋白偶聯制備免疫原與包被原；

步驟二，用上述制備的免疫原進行動物免疫，得到有機磷農藥通用抗體；

步驟三，通過化學方法合成Fe₃O₄磁性納米粒子，并進行表面修飾；

步驟四，將表面修飾后的Fe₃O₄磁性納米粒子與有機磷農藥通用抗體偶聯，并與膠體金結合，得到免疫磁珠；

步驟五，在試紙條的底板上加上硝酸纖維素膜，將有機磷通用半抗原與蛋白偶聯制備免疫原包被在膜上，封閉后成為檢測部分，確定最佳包被、封閉條件以及金標免疫磁珠的用量；

步驟六，利用免疫磁珠以及第五步中裝配的檢測試紙條對樣品進行檢測，獲得定性結果和定量結果。

優選地，步驟一中，所述有機磷通用半抗原分別與牛血清白蛋白和雞卵清白蛋白偶聯，得到免疫原與包被原。

優選地，步驟二中，所述動物為小白鼠或新西蘭大白兔。

優選地，步驟三中，所述化學方法為共沉淀法，所述表面修飾為用3-氨丙基三乙氧基硅烷對Fe₃O₄磁性納米粒子進行表面氨基硅烷化修飾。