[發(fā)明專利]利用畢赤酵母基因調(diào)控直接發(fā)酵制備一種抗腫瘤藥物復合物的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110219287.3
• 申請日: 2011-08-02
• 公開（公告）號: CN102911886A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱希強;劉飛;張莉;劉霞;釗倩倩;王紹花;陳勉;侯重文;袁丹丹;張林軍;陳曉燕
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省生物藥物研究院
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/63;C12N9/26;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種通過基因調(diào)控直接生產(chǎn)抗腫瘤藥物復合物的畢赤酵母基因工程菌HAS-PH20。

2.權(quán)利要求1所述的畢赤酵母，其特征在于：該酵母細胞為畢赤酵母KM71或SMD1168。

3.權(quán)利要求1所述的酵母基因工程菌TNF-PH20，其特征在于：先將重組質(zhì)粒pGAPZαA-tnf轉(zhuǎn)化畢赤酵母，得到重組酵母菌TNF；再將重組質(zhì)粒pPICZαA-ph20轉(zhuǎn)化酵母菌TNF，得到目標菌株TNF-PH20。

4.權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒pGAPZαA-tnf，其特征在于：在GAP組成型啟動子的調(diào)控下，該重組質(zhì)粒可表達TNF-α，所述的腫瘤壞死因子基因tnf具有腫瘤壞死因子堿基序列表中的堿基序列。

5.權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒pPICZαA-ph20，其特征在于：在AOX1誘導型啟動子的調(diào)控下，該重組質(zhì)粒可表達HAase；重組人透明質(zhì)酸酶基因ph20是按照畢赤酵母偏好性設(shè)計的DNA分子，該分子的核苷酸序列所編碼的氨基酸，與人透明質(zhì)酸酶基因(gene?ID6677)所編碼的氨基酸完全相同。

6.權(quán)利要求5所述的ph20基因序列，其特征在于：ph20基因序列是在人透明質(zhì)酸酶基因(gene?ID6677)基礎(chǔ)上，刪除了信號肽及Sac?Ⅰ酶切位點，再根據(jù)畢赤酵母密碼子用法將編碼脯氨酸，天冬氨酸，丙氨酸，絲氨酸等氨基酸的密碼子替換成CCA，GAA，GCA，UCA；共修改了18個堿基得到目的序列ph20，所述的ph20基因序列具有重組人透明質(zhì)酸酶堿基序列表中的堿基序列。

7.權(quán)利要求1中畢赤酵母基因工程菌TNF-PH20發(fā)酵生產(chǎn)抗腫瘤藥物復合物的方法，其特征在于：

在30℃條件下，利用YPD培養(yǎng)基將重組酵母菌TNF-PH20活化培養(yǎng)18～24小時；按0.5％～2％的比例將活化后的酵母菌轉(zhuǎn)接入YPD種子培養(yǎng)基中，上罐發(fā)酵方法如下：

(1)菌體培養(yǎng)階段：發(fā)酵溫度設(shè)定為28～30℃，利用28％的氨水將發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值調(diào)至5.0～6.0，然后按5％～10％的接種量將種子培養(yǎng)基接種入Basal?Salts上罐培養(yǎng)基中，同時添加4.37mL?PTM1鹽溶液。通氣攪拌18～24小時；

(2)甘油補料階段(腫瘤壞死因子組成型表達階段)：流加30％～50％的甘油，流加量為10～20mL/hr/L，培養(yǎng)24～48小時左右，整個過程中溶氧量大于20％。該過程既是酵母生長階段即菌體濕重增加階段，也是腫瘤壞死因子組成型表達階段，在此過程中TNF-α被快速積累；

(3)甲醇誘導階段(重組人透明質(zhì)酸酶誘導型表達階段)：流加甘油至一定時間后停止流加，更換甲醇為碳源，流加速度為4～8mL/hr/L，繼續(xù)培養(yǎng)24～48小時，整個過程中溶氧量大于20％。該過程流加甲醇可誘導AOX1啟動子作用并開始表達重組人透明質(zhì)酸酶，在此過程中可通過分別調(diào)控甘油及甲醇的流加時間來獲得TNF-α與HAase不同含量配比的抗腫瘤藥物復合物。