[發明專利]一種克氏原螯蝦C-型凝集素基因及制備方法和應用

有效

• 申請號: 201110217937.0
• 申請日: 2011-08-01
• 公開（公告）號: CN102321628A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 孟小林;徐進平;王健;張清濤
• 申請（專利權）人: 武漢凱肽來生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10;C12N1/21;C12N15/63;C07K14/435;A23K1/16;A61K38/17;A61K48/00;A61P31/04;A61P31/10;A61P31/12;A61P37/02;C12R1/19
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種分離的克氏原螯蝦C-型凝集素基因，其序列為SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。

2.一種分離的克氏原螯蝦C-型凝集素蛋白，其序列為SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列。

3.權利要求1或2所述的一種克氏原螯蝦C-型凝集素基因的制備方法，其步驟是：

A、總RNA的提取：取克氏原螯蝦肝胰腺100ug，加入1ml?TRIzol?Reagent?RNA提取試劑，用研磨棒研磨；

B、cDNA第一鏈的合成：取步驟(A)中的總RNA?5ug，以1ul?Oligo(dT)₂₀為引物，2ul?dNTP，4ul?5×RT?buffer，1ul?Rnase?Inhibitor，1ul?ReverTraAce反轉錄酶，加ddH2O至終體積為20ul，反轉錄程序為42℃?60min，99℃?5min，4℃?5min，得到cDNA；

C-型凝集素基因部分核苷酸序列的獲得：設計一對引物ClecF及ClecR，取步驟(B)中的cDNA?2ul，加入引物ClecF及ClecR各1ul，2ul?dNTP，2ul?MgSO4，5ul?10×KOD?buffer，1ul?KOD-Plus，36ul?ddH2O，PCR程序為94℃?5min；94℃?30s，56℃?30s，68℃?30s，30cycles；68℃?10min；4℃?5min；

ClecF：5’-GTTATTGACGACTCCACCTT-3’正向

ClecR：5’-GTCTTCCCATTGACCCACTT-3’反向；

PCR產物用TIANGEN?Gel?Extraction?Kit純化后用引物ClecF及ClecR進行雙向測序，得到Pc-Clec基因部分核苷酸序列；

C、3’-RACE：C-犁凝集素基因3’端核苷酸序列的獲得：

根據步驟(B)中得到的Pc-Clec基因部分核苷酸序列信息設計二條特異性正向引物：

Clec-3：5’-TGACGACTCCACCTTCATGGAGGCTCT-3’

Clec-n3：5’-TGGAGGCTCTTACGGACTACATCTTGGA-3’；

3’-RACE-Ready?cDNA的獲得：取步驟(A)中的總RNA?3ug，以3’-RACE?CDS?PrimerA3’為反轉錄引物，反轉錄所需其他試劑及反轉錄程序按SMART^TM?RACE?cDNA?Amplification?Kit，得到3’-RACE-Ready?cDNA；

3’-First?round?PCR：取1ul?3’-RACE-Ready?cDNA為模板，用特異性引物Clec-3及10×UPM引物進行3’-First?round?PCR擴增，得到3’-First?round?PCR產物；

3’-NET?PCR：取1ul?3’-First?round?PCR產物為模板，用特異性引物Clec-n3與NUP引物進行5’-NET-PCR擴增，PCR反應條件為：94℃?2分鐘；94℃?30秒，60℃?30秒，68℃?30秒，30cycles；68℃?5分鐘；25℃?5分鐘，得到3’-NETPCR產物；

3’端核苷酸序列的獲得：將3’-NET-PCR擴增產物用TIANGEN?Gel?Extraction?Kit純化后用引物Clec-n3及NUP進行雙向測序，獲得克氏原螯蝦C-犁凝集素基因的3’端序列；

D、5’-RACE：C-犁凝集素基因5’端核苷酸序列的獲得：

根據步驟(C)中得到的Pc-Clec片段核苷酸序列信息設計二條特異性反向引物：

Clec-5：5’-GTCTTCCCATTGACCCACTTCCACACC-3’；

Clec-n5：5’-CTTCCACACCCCTTCCGTCACCTCGT-3’；

5’-RACE-Ready?cDNA的獲得：取步驟(A)中的肝胰腺總RNA?5ug，以SMARTIIAOligonucleotide引物及5’-RACE?CDS?PrimerA引物進行反轉錄，反轉錄程序按SMART^TM?RACEcDNA?Amplification?Kit試劑盒進行，得到5’-RACE-Ready?cDNA；

5’-First?round?PCR：取1ul?5’-RACE-Ready?cDNA為模板，用特異性引物Clec-5及10×UPM引物進行5’-First?round?PCR擴增，得到5’-First?round?PCR產物；

5’-NET?PCR：取1ul?5’-First?round?PCR產物為模板，用特異性引物Clec-n5與NUP引物進行5’-NET-PCR擴增，PCR反應條件為：94℃?2分鐘；94℃?30秒，60℃?30秒，68℃?30秒，30cycles；68℃?5分鐘；25℃?5分鐘，得到5’-NET?PCR產物；

5’端核苷酸序列的獲得：將5’-NET-PCR產物用TIANGEN?Gel?Extraction?Kit純化后用引物Clec-n5及NUP進行雙向測序，獲得克氏原螯蝦C-犁凝集素基因的5’端序列；

E、C-型凝集素基因完整核苷酸序列的獲得：將3’-RACE獲得的克氏原螯蝦C-犁凝集素的3’端序列及5’-RACE獲得的克氏原螯蝦C-犁凝集素的5’端序列用DNAssist?Version?2.0進行拼接，得到完整的C-犁凝集素基因核苷酸序列；

F、C-犁凝集素基因所編碼的蛋白質的氨基酸序列：用生物學軟件對(E)中獲得的C-犁凝集素基因核苷酸序列進行ORF?Finding分析，含有的完整ORF長為510bp，編碼169個氨基酸的多肽，該多肽理論蛋白質分子量為19KD。