[發明專利]貪噬菌CGMCC4969及其在生物轉化3-氰基吡啶生成煙酰胺中的應用

無效

• 申請號: 201110215982.2
• 申請日: 2011-07-30
• 公開（公告）號: CN102286406A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 戴亦軍;張會娟;周倩雯;曹玉敏;袁生
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/60;C12P17/12;C12R1/01;C12R1/19
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及貪噬菌V.boronicumulans?CGMCC?4969?及其產生的腈水合酶基因簇應用于3-氰基吡啶生物轉化為煙酰胺。?

背景技術

腈水合酶(nitrile?hydratase，EC.4.2.1.84)(簡寫為NHase)催化腈化物水合生成相應的酰胺類化合物。來源于微生物的腈水合酶具有反應條件溫和、產率高、副產物少、區域和立體選擇性強等優點，已成功應用于醫藥、農藥及其中間體、食品與飼料添加劑等精細化學品的生產，并顯示出巨大發展潛力。?

目前報道的產生腈水合酶的微生物有：根癌土壤桿菌Agrobacterium?tumefaciens?d3、節桿菌Arthrobactersp.?J-1、蠟狀芽孢標桿菌Bacillus?cereus、芽孢桿菌Bacillus?sp.?BR?449、史氏芽孢桿菌Bacillus?smithii?SC-J05-1、短桿菌Brevibacterium?imperialis?CBS?489-74、諾卡氏菌Nocardiasp.?108、綠針假單胞菌Pseudomonas?chlororaphis?B23、惡臭假單胞菌Pseudomonas?putida、嗜熱假諾卡氏菌Pseudonocardia?thermophila?JCM?3095、玫瑰紅紅球菌Rhodococcus?rhodochrous?J1、玫瑰紅紅球菌Rhodococcus?rhodochrous?R312、玫瑰紅紅球菌Rhodococcus?rhodochrous?LL?100-21、紅平紅球菌Rhodococcus?erythropolis?BL1、玫瑰紅紅球菌Rhodococcus?rhodochrous?A4、紅球菌Rhodococcussp.?AJ270、紅球菌Rhodococcussp.?SHZ-1、紅球菌Rhodococcussp.?ZJUT-N595、紅球菌Rhodococcussp.?N?774、高里假絲酵母Candida?guilliermondii?CCT?7207、著明假絲酵母Candida?famata、黃隱球酵母Cryptococcus?flavus?UFMG-Y61（鄭裕國等，腈轉化酶在精細化學品生產中的應用，生物工程學報，2009，25?(12):?1795-1807）。對貪噬菌屬Variovorax產生的腈水合酶而言，目前在Genbank數據庫中有Lourenco等提交的224bp來源于Variovorax?sp.?DSM?11402的部分腈水合酶基因片段（genbank登錄號：AJ577856）；來源于V.?paradoxus?EPS（Genbank登錄號：NC_014931）和V.?paradoxus?S110（Genbank登錄號：NC_012791）兩個菌株的全基因組序列中的腈水合酶基因，然而上述腈水合酶基因均為生物信息學預測結果，未有實驗證明其腈水合酶功能。?

發明內容

本發明的目的是提供一種能產生腈水合酶的菌株及其在生物轉化3-氰基吡啶生成煙酰胺中的應用；以及從該菌株中克隆腈水合酶基因簇并在E.?coli?BL21（DE3）中誘導表達；重組表達菌株在生物轉化3-氰基吡啶生成煙酰胺中的應用。本發明的基本原理如圖1所示。?

申請人篩選到一株命名為J1的菌株，該菌株可生物轉化3-氰基吡啶生成煙酰胺。從該菌株中克隆出完整的腈水合酶α和β亞基基因簇，其堿基由序列表中SEQ?ID?No：1組成。將由SEQ?ID?No：1組成的DNA重組于pET28a質粒上，重組質粒pET28a-NHase電轉化至E.?coli?BL21（DE3）菌株中，經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導表達，含表達腈水合酶的E.?coli?BL21（DE3）菌株可轉化3-氰基吡啶生成煙酰胺，而不含腈水合酶基因的對照菌株不能轉化3-氰基吡啶為煙酰胺。?

本發明所提供的菌株J1為一種貪噬菌V.boronicumulans，該菌株現保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號CGMCC?4969?。?