[發明專利]畢赤酵母壁蛋白Gcw34及其表面展示系統和構建方法

有效

• 申請號: 201110215812.4
• 申請日: 2011-07-29
• 公開（公告）號: CN102260331A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 林影;張莉;周新瑩;葉燕銳;韓雙艷;鄭穗平
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C07K14/39
• 分類號: C07K14/39;C12N15/31;C12N15/81;C12N1/19
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw34及其構建的表面展示系統和構建方法。

背景技術

微生物細胞表面展示技術是一種通過錨定蛋白將蛋白質或多肽固定在細胞表面的技術。微生物細胞表面展示系統包括宿主菌、錨定蛋白和靶蛋白，有時在錨定蛋白和靶蛋白之間也添加一段連接（linker）序列。微生物細胞表面展示在多肽分離、全細胞催化劑、全細胞吸附劑、疫苗和抗體生產、蛋白文庫篩選、生物傳感器、生物修復等方面都有廣闊的應用前景。

目前在微生物表面展示系統中應用比較多的宿主菌主要有噬菌體、細菌（如大腸桿菌Escherichia.?coli、奇異變形菌Proteus?mirabilis等）、釀酒酵母（Saccharomyces?cerevisiae）和巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）。表面展示使用的錨定蛋白一般具有以下特征：（1）較牢固地錨定在細胞表面，不會輕易地從細胞表面脫落；（2）可以與靶蛋白序列有效融合而不影響靶蛋白的結構和功能；（3）對蛋白酶有一定的抗性。細菌表面展示系統的錨定蛋白主要有細菌菌毛蛋白、S層蛋白、冰核蛋白（INP）和一些外膜蛋白。釀酒酵母表面展示系統的錨定蛋白主要有凝集素系統、絮凝素系統和其它GPI錨定（glycosylphosphatidylinositol?anchored）蛋白系統和一些Pir蛋白系統。巴斯德畢赤酵母具有可以實現高密度發酵（細胞密度可高達140g/L）、蛋白適度糖基化和發酵培養基組成簡單等優點，在微生物細胞表面展示方面的應用具有非常廣闊的前景，目前已有許多種蛋白，如解脂耶氏酵母脂肪酶、乳酸克魯維酵母黃酶、米根霉脂肪酶等已經成功地展示在巴斯德畢赤酵母表面。目前巴斯德畢赤酵母表面展示系統中使用的錨定蛋白主要來自釀酒酵母的凝集素系統、絮凝素系統和Sed1p蛋白等。但是，這些錨定蛋白不是畢赤酵母的組成成分，而是通過人為手段外源引進的。因此用外源壁蛋白作為畢赤酵母表面展示系統的錨定蛋白，可能會與內源壁蛋白競爭壁蛋白結合位點，導致展示效率不高。

Khasa?YP?(Khasa?YP,?et?al.?Isolation?of?Pichia?pastoris?PIR?genes?and?their?utilization?for?cell?surface?display?and?recombinant?protein?secretion.?Yeast.?2010.?(published?online).)等報道了利用畢赤酵母Pir蛋白作為錨定蛋白進行外源蛋白的細胞表面展示。但發明人發現Pir蛋白本身的表達量較低，作為畢赤酵母表面展示系統的錨定蛋白效果一般。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提高用于巴斯德畢赤酵母表面展示系統的內源錨定蛋白的表達效率。

本發明解決上述問題的技術方案是：

一種巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw34，該蛋白的氨基酸序列為SEQ?NO：1。

本發明所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白由451個氨基酸組成，大小約為49.5KDa。本發明所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白以共價鍵的形式結合在巴斯德畢赤酵母細胞壁上，用十二烷基硫酸鈉法不能提取，可以用β-1,3-葡聚糖酶法提取。

本發明所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw34可用于構建畢赤酵母細胞表面展示系統，所述的巴斯德畢赤酵母細胞表面展示系統是以所述壁蛋白為錨定蛋白將靶蛋白固定在畢赤酵母細胞表面構成的。

編碼所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW34的基因，核苷酸序列如SEQ?NO：4所示。

一種巴斯德畢赤酵母細胞表面展示系統，是以所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw34為錨定蛋白，將靶蛋白固定在巴斯德畢赤酵母細胞表面構成的。

上述巴斯德畢赤酵母細胞表面展示系統可通過以下步驟構建：

（1）將權利要求2所述的基因克隆到表達載體的表達盒中，得到以權利要求1所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白為錨定蛋白的表面展示表達載體；

（2）將靶蛋白的基因序列克隆到所述表面展示表達載體的巴斯德畢赤酵母壁蛋白基因序列的上游，與所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白基因形成融合基因；

（3）轉化巴斯德畢赤酵母，根據所述表達載體上的篩選標記篩選陽性轉化子，即得到表面展示系統。

所述靶蛋白為堿性木聚糖酶、米黑根毛霉脂肪酶或南極假絲酵母脂肪酶B。

所述巴斯德畢赤酵母為巴斯德畢赤酵母GS115。