[發(fā)明專(zhuān)利]畢赤酵母壁蛋白Gcw51及其表面展示系統(tǒng)和構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110215811.X
• 申請(qǐng)日: 2011-07-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102276703A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林影;張莉;周新瑩;葉燕銳;韓雙艷;鄭穗平
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/39
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/39;C12N15/31;C12N1/19;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 廣州粵高專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw51及其構(gòu)建的表面展示系統(tǒng)和構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

[0002]?目前在微生物表面展示系統(tǒng)中應(yīng)用比較多的宿主菌主要有噬菌體、細(xì)菌（如大腸桿菌Escherichia.?coli、奇異變形菌Proteus?mirabilis等）、釀酒酵母（Saccharomyces?cerevisiae）和巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）。表面展示使用的錨定蛋白一般具有以下特征：（1）較牢固地錨定在細(xì)胞表面，不會(huì)輕易地從細(xì)胞表面脫落；（2）可以與靶蛋白序列有效融合而不影響靶蛋白的結(jié)構(gòu)和功能；（3）對(duì)蛋白酶有一定的抗性。細(xì)菌表面展示系統(tǒng)的錨定蛋白主要有細(xì)菌菌毛蛋白、S層蛋白、冰核蛋白（INP）和一些外膜蛋白。釀酒酵母表面展示系統(tǒng)的錨定蛋白主要有凝集素系統(tǒng)、絮凝素系統(tǒng)和其它GPI錨定（glycosylphosphatidylinositol?anchored）蛋白系統(tǒng)和一些Pir蛋白系統(tǒng)。巴斯德畢赤酵母具有可以實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵（細(xì)胞密度可高達(dá)140g/L）、蛋白適度糖基化和發(fā)酵培養(yǎng)基組成簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在微生物細(xì)胞表面展示方面的應(yīng)用具有非常廣闊的前景，目前已有許多種蛋白，如解脂耶氏酵母脂肪酶、乳酸克魯維酵母黃酶、米根霉脂肪酶等已經(jīng)成功地展示在巴斯德畢赤酵母表面。目前巴斯德畢赤酵母表面展示系統(tǒng)中使用的錨定蛋白主要來(lái)自釀酒酵母的凝集素系統(tǒng)、絮凝素系統(tǒng)和Sed1p蛋白等。但是，這些錨定蛋白不是畢赤酵母的組成成分，而是通過(guò)人為手段外源引進(jìn)的。因此用外源壁蛋白作為畢赤酵母表面展示系統(tǒng)的錨定蛋白，可能會(huì)與內(nèi)源壁蛋白競(jìng)爭(zhēng)壁蛋白結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致展示效率不高。

Khasa?YP?(Khasa?YP,?et?al.?Isolation?of?Pichia?pastoris?PIR?genes?and?their?utilization?for?cell?surface?display?and?recombinant?protein?secretion.?Yeast.?2010.?(published?online).)等報(bào)道了利用畢赤酵母Pir蛋白作為錨定蛋白進(jìn)行外源蛋白的細(xì)胞表面展示。但發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Pir蛋白本身的表達(dá)量較低，作為畢赤酵母表面展示系統(tǒng)的錨定蛋白效果一般。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提高用于巴斯德畢赤酵母表面展示系統(tǒng)的內(nèi)源錨定蛋白的表達(dá)效率。

本發(fā)明解決上述問(wèn)題的技術(shù)方案是：

一種巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw51，該蛋白的氨基酸序列為SEQ?NO：1。

本發(fā)明所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白由194個(gè)氨基酸組成，大小約為19.8KDa。本發(fā)明所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白以共價(jià)鍵的形式結(jié)合在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞壁上，用十二烷基硫酸鈉法不能提取，可以用β-1,3-葡聚糖酶法提取。

本發(fā)明所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw51可用于構(gòu)建畢赤酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)，所述的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)是以所述壁蛋白為錨定蛋白將靶蛋白固定在畢赤酵母細(xì)胞表面構(gòu)成的。

編碼所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW51的基因，核苷酸序列如SEQ?NO：4所示。

一種巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)，是以所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw51為錨定蛋白，將靶蛋白固定在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面構(gòu)成的。

上述巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)可通過(guò)以下步驟構(gòu)建：

（1）將權(quán)利要求2所述的基因克隆到表達(dá)載體的表達(dá)盒中，得到以權(quán)利要求1所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白為錨定蛋白的表面展示表達(dá)載體；

（2）將靶蛋白的基因序列克隆到所述表面展示表達(dá)載體的巴斯德畢赤酵母壁蛋白基因序列的上游，與所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白基因形成融合基因；

（3）轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母，根據(jù)所述表達(dá)載體上的篩選標(biāo)記篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，即得到表面展示系統(tǒng)。

所述靶蛋白為堿性木聚糖酶、米黑根毛霉脂肪酶或南極假絲酵母脂肪酶B。

所述巴斯德畢赤酵母為巴斯德畢赤酵母GS115。

上述方法中，所述的表達(dá)載體是常用的帶有分泌信號(hào)肽序列的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體，如pPIC9K、pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pGAPZαA、pGAPZαB、pGAPZαC等；如果是無(wú)信號(hào)肽的表達(dá)載體，可在靶蛋白基因序列的上游添加分泌信號(hào)肽序列。