[發明專利]檢測致病曲霉菌的熒光定量PCR通用引物、檢測探針和試劑盒

無效

• 申請號: 201110214986.9
• 申請日: 2011-07-29
• 公開（公告）號: CN102321738A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 黎毅敏;邱桂霞;毛璞;楊淳;黃紅川;劉冬冬;劉曉青;何為群;莫紅纓
• 申請（專利權）人: 廣州呼吸疾病研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香;曾旻輝

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地是涉及一種檢測致病曲霉菌的熒光定量PCR通用引物、檢測探針和試劑盒。

背景技術

近年來，隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑的廣泛應用以及血液惡性腫瘤、器官移植等免疫低下人群的不斷增多，深部真菌感染的發病率正在急劇上升。其中，曲霉菌在免疫力低下患者中已成為僅次于白色念珠菌的重要致病真菌。在免疫缺陷患者中，曲霉菌感染的發病率高達50％。曲霉菌感染，特別是侵襲性曲霉病預后很差，盡管新的抗真菌藥不斷出現并用于臨床治療，但是病死率仍高達50％～90％。由于該病臨床表現無特異性，致使診斷較為困難，約30％的病例在尸檢時才能確診。早期診斷曲霉菌感染是提高患者生存率和改善患者預后的關鍵，發展早期快速診斷曲霉菌感染的新方法已刻不容緩。

目前，臨床上常用的診斷方法包括：真菌顯微鏡檢查和培養、組織病理學檢查、影像學檢查以及血清學檢查。但是，這些方法都存在一定的缺陷和局限性：傳統的培養及鏡檢方法陽性率低、耗時長；組織病理學檢查為侵入性操作，不易取材，且需要免疫組化方法來進一步鑒定菌種；影像學檢查所見的Halo征是侵襲性肺曲霉菌病早期的特征性表現，但缺乏特異性；血清學檢查特異性抗原或代謝產物的方法如檢測半乳甘露聚糖抗原(GM抗原)和(1→3)2β2D2葡聚糖(G實驗)雖然快速簡便，但其敏感性、特異性以及在早期診斷、病情監測方面的價值仍然不能令人滿意，且無法鑒定曲霉菌的菌種。

目前最有發展前景的是分子生物學方法----多聚酶鏈反應(PCR)技術。

傳統的PCR技術：最常用于曲霉菌診斷的傳統PCR技術是巢式PCR(nested-PCR)，是通過“外”、“內”兩對引物完成的兩輪PCR反應，即一對擴增較大DNA片段的外引物和一對以擴增產物為模板再擴增小片段的內引物。巢式PCR雖較靈敏，但需進行兩次PCR，增加了污染機會，提高了其假陽性率。

實時定量PCR技術：傳統PCR技術的另一缺陷是PCR產物不易定量，自1995年美國PE公司提出實時PCR檢測原理后，實時定量PCR(real-time?PCR)以其快速、靈敏、特異、定量、無交叉污染等突出優點在醫學領域得到廣泛應用，在曲霉菌感染的診斷中已展現出誘人的前景。主要包括以下幾種：

1.非特異性熒光染料染色法(SYBR?Green?I染料)：熒光染料能特異性地結合雙鏈DNA，而不結合單鏈DNA。此種方法的優點是簡便易行，缺點主要是特異性不強，染料可以和任何雙鏈DNA結合，不能區分引物二聚體、非特異性擴增產物與特異性擴增產物。為了減少非特異擴增產物和引物二聚體的干擾，可以在PCR完成后立即進行融解曲線分析。

2.特異性探針雜交方法：因為熒光染料法特異性不高，而且不適合進行多重PCR分析，為了克服這些缺陷，人們發展了特異性熒光探針雜交技術，包括Taqman探針、分子信標、Scorpion引物，雜交探針方法等方法。

過去，國內外大部分關于曲霉菌DNA檢測的研究都主要集中于被認為是主要感染菌的煙曲霉菌，或僅為曲霉菌屬，而不鑒定到種。但最近有報道指其它種類的曲霉菌種感染也在不斷增多，例如包括黃曲霉，黑曲霉和土曲霉，95％以上的侵襲性曲霉病由以上四種曲霉菌感染造成。此外，有研究指，土曲霉對傳統的抗真菌藥兩性霉素B顯示出逐漸升高的耐藥趨勢，因此，種的進一步區分顯得尤為重要。

本發明擬借助TaqMan熒光定量PCR技術，通過構造特異性的多重熒光探針和通用引物，建立一種能同時檢測鑒定煙曲霉，黃曲霉，黑曲霉，和土曲霉四種曲霉菌的多重熒光定量PCR診斷技術，更好的擴展和完善了除煙曲霉菌外的檢測能力，并且具有同樣高的敏感性和特異性，以利于侵襲性曲霉菌病的早期診斷和針對性治療。

發明內容

為了克服現存各種曲霉菌檢測技術的缺陷性和局限性，本發明的目的之一是一種可用于曲霉菌的熒光定量PCR檢測的通用引物。

實現該目的的技術方案如下：

一種用于曲霉菌的熒光定量PCR檢測的通用引物，其堿基組成如SEQID.NO：1和SEQ?ID.NO：2所示。

本發明的另一目的是提供一種用于曲霉菌的熒光定量PCR的檢測探針，該探針是分別針對四種主要致病性曲霉菌包括煙曲霉，黃曲霉，黑曲霉，土曲霉特異性基因序列的。

實現該目的的技術方案如下：