[發明專利]小蔓長春花細胞大規模培養生成長春胺的方法

無效

• 申請號: 201110214583.4
• 申請日: 2011-07-29
• 公開（公告）號: CN102367460A
• 公開（公告）日: 2012-03-07
• 發明（設計）人: 倪迪安;倪新忠
• 申請（專利權）人: 無錫維開敏生物科技有限公司
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12N5/04;C12R1/91
• 代理公司: 上海浦東良風專利代理有限責任公司 31113
• 代理人: 潘志龍

1.一種小蔓長春花細胞大規模培養生成長春胺的方法，其特征在于：包括如下步驟：

1）分別制備固體生長培養基、液體生長培養基：取MS基本培養基，以每升加入0.001~0.002克萘乙酸和6~7克瓊脂粉為單位，得固體生長培養基備用；另取MS基本培養基，以每升加入0.001~0.002克萘乙酸為單位，得液體生長培養基備用；

2）小蔓長春花細胞系的制備：以長春花葉片為外植體，將其用濃度為70%~75%醫用乙醇浸泡30秒，隨后轉移至濃度為10%~12%的次氯酸鈉水溶液中進行表面消毒；將消毒后的外植體播種于固體生長培養基中，在溫度為25+1℃下，經4周~5周暗培養后，外植體的切口處形成愈傷組織；將得到的愈傷組織繼續在所述固體生長培養基中培養，培養溫度為25+1℃，3周~4周繼代一次，培養10代后，得松軟愈傷組織；將所述松軟愈傷組織繼續繼代培養8~10代，得細胞系；

3）長春胺的制備：將步驟2所得細胞系作為種源，接種于液體生長培養基中擴增，培養條件為溫度25+1℃、暗培養、搖床轉速150~170轉/分鐘或螺旋葉輪轉速100轉/分鐘、培養8天~10天，得種子細胞；將所得種子細胞在所述液體生長培養基中接種，接種量為6~15%W/V，繼續培養7天~12天，培養條件為溫度25+1℃、暗培養、搖床轉速150轉/分鐘~170轉/分鐘或螺旋葉輪轉速100轉/分鐘；隨后從所得培養液中提取獲得生物堿長春胺。

2.根據權利要求1?所述的小蔓長春花細胞大規模培養生成長春胺的方法，其特征在于：將步驟1中所述固體生長培養基、液體生長培養基分別經高壓滅菌后，調節pH值至5.7~5.8。

3.根據權利要求1或2?所述的小蔓長春花細胞大規模培養生成長春胺的方法，其特征在于：將步驟1中所述固體基本培養基、液體生長培養基分別經高壓滅菌后，用HCl或NaOH或兩者結合調節固體生長培養基、液體生長培養基的pH值至5.7~5.8。

4.根據權利要求1?所述的小蔓長春花細胞大規模培養生成長春胺的方法，其特征在于：將步驟1中所述固體生長培養基、液體生長培養基分別分裝于反應器中備用。

5.根據權利要求4所述的小蔓長春花細胞大規模培養生成長春胺的方法，其特征在于：所述反應器的容積為0.2升~1000升，所述反應器中固體生長培養基、液體生長培養基的體積分別占反應器容積的25%~80%。