[發(fā)明專利]小蔓長(zhǎng)春花細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生成長(zhǎng)春胺的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110214583.4
• 申請(qǐng)日: 2011-07-29
• 公開（公告）號(hào): CN102367460A
• 公開（公告）日: 2012-03-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 倪迪安;倪新忠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 無(wú)錫維開敏生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12P17/18
• 分類號(hào): C12P17/18;C12N5/04;C12R1/91
• 代理公司: 上海浦東良風(fēng)專利代理有限責(zé)任公司 31113
• 代理人: 潘志龍

1.一種小蔓長(zhǎng)春花細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生成長(zhǎng)春胺的方法，其特征在于：包括如下步驟：

1）分別制備固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基、液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基：取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入0.001~0.002克萘乙酸和6~7克瓊脂粉為單位，得固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基備用；另取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入0.001~0.002克萘乙酸為單位，得液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基備用；

2）小蔓長(zhǎng)春花細(xì)胞系的制備：以長(zhǎng)春花葉片為外植體，將其用濃度為70%~75%醫(yī)用乙醇浸泡30秒，隨后轉(zhuǎn)移至濃度為10%~12%的次氯酸鈉水溶液中進(jìn)行表面消毒；將消毒后的外植體播種于固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在溫度為25+1℃下，經(jīng)4周~5周暗培養(yǎng)后，外植體的切口處形成愈傷組織；將得到的愈傷組織繼續(xù)在所述固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25+1℃，3周~4周繼代一次，培養(yǎng)10代后，得松軟愈傷組織；將所述松軟愈傷組織繼續(xù)繼代培養(yǎng)8~10代，得細(xì)胞系；

3）長(zhǎng)春胺的制備：將步驟2所得細(xì)胞系作為種源，接種于液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中擴(kuò)增，培養(yǎng)條件為溫度25+1℃、暗培養(yǎng)、搖床轉(zhuǎn)速150~170轉(zhuǎn)/分鐘或螺旋葉輪轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘、培養(yǎng)8天~10天，得種子細(xì)胞；將所得種子細(xì)胞在所述液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中接種，接種量為6~15%W/V，繼續(xù)培養(yǎng)7天~12天，培養(yǎng)條件為溫度25+1℃、暗培養(yǎng)、搖床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘~170轉(zhuǎn)/分鐘或螺旋葉輪轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘；隨后從所得培養(yǎng)液中提取獲得生物堿長(zhǎng)春胺。

2.根據(jù)權(quán)利要求1?所述的小蔓長(zhǎng)春花細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生成長(zhǎng)春胺的方法，其特征在于：將步驟1中所述固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基、液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基分別經(jīng)高壓滅菌后，調(diào)節(jié)pH值至5.7~5.8。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2?所述的小蔓長(zhǎng)春花細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生成長(zhǎng)春胺的方法，其特征在于：將步驟1中所述固體基本培養(yǎng)基、液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基分別經(jīng)高壓滅菌后，用HCl或NaOH或兩者結(jié)合調(diào)節(jié)固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基、液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH值至5.7~5.8。

4.根據(jù)權(quán)利要求1?所述的小蔓長(zhǎng)春花細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生成長(zhǎng)春胺的方法，其特征在于：將步驟1中所述固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基、液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基分別分裝于反應(yīng)器中備用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的小蔓長(zhǎng)春花細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生成長(zhǎng)春胺的方法，其特征在于：所述反應(yīng)器的容積為0.2升~1000升，所述反應(yīng)器中固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基、液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基的體積分別占反應(yīng)器容積的25%~80%。