[發明專利]一種通過培養龍牙楤木體細胞胚生產有用次生代謝物質的方法

無效

• 申請號: 201110214552.9
• 申請日: 2011-07-29
• 公開（公告）號: CN102893858A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 由香玲;曲冠證;詹亞光;代金玲;陶雷;譚嘯;尹靜;范桂枝;曾繁瑣;齊鳳慧
• 申請（專利權）人: 東北林業大學;由香玲;曲冠證
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明專利涉及通過組織培養龍牙楤木體細胞胚發生，體細胞胚苗中三種有用次生代謝物質：楤木總皂苷、齊墩果酸、總黃酮有效累積的培養方法。本發明屬農業生物技術領域。

背景技術

龍牙楤木(Aralia?elata?Seem.)為五加科落葉灌木或小喬木。其根皮中主要含有楤木皂苷和黃酮類等重要藥用成分，而皂苷的主要成分是齊墩果酸型皂苷(王玉萍等，中國中藥雜志，1998，23(9)：519-521)。楤木皂苷和黃酮類具有抗炎、鎮靜、利尿、強心、抗氧化、抗病毒、抗糖尿病并發癥等多種生理活性及藥理作用，且無毒害。近年來的研究顯示龍牙楤木皂苷在免疫調節、腫瘤防治方面有很顯著的作用，這使其在國際市場上越來越受到人們的關注(王忠壯等，上海：第二軍醫大學出版社，2001)。然而龍牙楤木的野生資源由于破壞性、掠奪性連年多茬采收，甚至割莖移栽，使其資源接近瀕危(高德武等，國土與自然資源研究，2001(3)：77-78)。

而通過細胞培養生產有用次生代謝物是一條可選的解決問題的途徑。通常情況下，植物次生代謝物的積累與植物細胞的分化程度有關，分化程度越高，次生代謝物的積累也越多。體細胞胚是一種很好的培養材料。雖然以快繁為目的體細胞胚規模化培養有不少研究報道，例如：生物反應器培養挪威云杉(Picea?abies)、白云杉(Picea?glauca)、仙客來(Cyclamen?persicum)、白樺(Betula?pendula)的體細胞胚等。而以研究次生代謝物質累積為目的的大量培養的報道卻不多。在刺五加體細胞胚培養中，其外植體材料有從胚性細胞開始的，也有從魚雷胚開始的(邢朝斌等，中草藥，2009，40(8)：1302-1305)，而且僅僅是考察了其生物生長量，對其中的有效成分未做分析。從胚性愈傷組織到體細胞胚發生發育的過程是細胞有序的分化、發育的過程，而該過程中目的次生代謝物的累積具體如何還未查到相關報道。龍牙楤木方面的研究也未見報道。本發明的目的是通過培養龍牙楤木體細胞胚發生，提供一種有效生產三種次生代謝物質(總皂苷、齊墩果酸、總黃酮)的方法，為龍牙楤木規模化培養生產藥用產物提供一種培養技術。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用體細胞胚發生過程中的特殊發育材料，更有效地生產有用次生代謝物質的方法。具體發明內容如下。

將培養萌發7天的無菌實生苗根部切成1cm根段接種到1/2SH+3.0mg/L?IBA+0.2mg/L?KT培養條件下誘導胚性愈傷組織，并在同樣條件下進行愈傷組織的增殖。將0.8g胚性愈傷組織分別接種入裝有50mL分化培養基和增殖培養基的150ml玻璃三角瓶中進行搖瓶懸浮培養，該分化培養基和增殖培養基的組成分別是1/2SH+1.0mg/L?IBA+0.2mg/L?KT+20g/L蔗糖，1/2SH+3.0mg/L?IBA+0.2mg/L?KT+20g/L蔗糖。搖床轉速為110rpm/min。每隔2周繼代一次。增殖懸浮培養的胚性愈傷組織4周后取材，烘干稱重。分化懸浮培養的愈傷組織培養2周時，細胞分化為球形胚，此時取材，烘干稱重。懸浮培養4周后體細胞胚發育到魚雷和子葉胚時，轉入固體培養，在無任何植物生長調節劑的WPM培養基中進行萌發。待生長3周后，取材烘干稱重。分析上述所取的愈傷組織、球形和心形體細胞胚、魚雷和子葉體細胞胚、體細胞胚萌發苗中的楤木總皂苷、齊墩果酸、總黃酮含量。以6-7月份采集的3-4年生人工栽培苗木根和當年生葉片為對照樣品。楤木總皂苷和總黃酮含量分別以齊墩果酸和蘆丁為標準品，采用分光光度法分析，監測波長分別為540和510nm。齊墩果酸含量以相同物質為標準品，采用高壓液相(HPLC)分析。體細胞胚苗中各成分的含量最高，分別為：總皂苷2.1％，占栽培植株根中含量的29.7％；齊墩果酸1.04％，占栽培植株根中含量的29.9％；總黃酮2.3％，占栽培植株葉中含量的42.8％。分析出各種成分的含量后，根據生長速率(干重g/周)算出其累積效率(mg/周)＝各成分含量(％)*生長速率(mg/周)。上述體細胞胚發生過程的各材料中，體細胞胚苗的三種物質累積效率最高，分別為：總皂苷6.72mg/周、齊墩果酸3.42mg/周、總黃酮7.36mg/周。

本發明中所用的培養基都是按常規處理(調整pH值為5.8，經過高溫高壓滅菌(121℃、1.5個大氣壓、15分鐘))后使用的，培養環境為常規組織培養室(溫度24～26℃，光照強度1000～1500Lx，光/暗周期16h/8h，濕度60％～70％)。

本發明的優點：