[發明專利]一種新型耐高溫β-葡萄糖苷酶及其編碼基因和應用

有效

• 申請號: 201110214130.1
• 申請日: 2011-07-28
• 公開（公告）號: CN102899300A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 周志華;王錢福;錢昌麗;劉寧;嚴興;魏維;王倩;謝磊;黃勇平
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19;C12N5/10;C12P19/14;C12P19/02;C12P33/20;C12P1/00;C12P7/22
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種新型耐高溫β-葡萄糖苷酶及其編碼基因和應用。

背景技術

纖維素簡介。纖維素是多個葡萄糖殘基以β-1，4-糖苷鏈連接而成的多聚物，是地球上最豐富的可再生的生物質資源。以木質纖維素為原料、用纖維素酶水解纖維素生成葡萄糖，進而發酵為燃料乙醇成為應對當今世界能源危機、環境污染等問題的重要出路。

纖維素酶簡介。纖維素酶是指能夠將纖維素轉化成葡萄糖的一系列酶的總稱，主要包括內切葡聚糖酶(endo-β-1，4-glucanase，EC?3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，EC?3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC?3.2.1.21)。內切葡聚糖酶作用于纖維素長鏈分子的內部將長纖維切成短纖維，外切葡聚糖酶作用于纖維素分子的一端，以兩個葡萄糖殘基為單位進行切割生成纖維二糖，β-葡萄糖苷酶切割纖維二糖及一些纖維寡糖最終生成單個的葡萄糖分子。

β-葡萄糖苷酶在生物能源領域的作用。作為纖維素復合酶系的重要組成之一，β-葡萄糖苷酶的關鍵作用主要體現在兩個方面：一方面，由于纖維二糖積累對其上游內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活性具有顯著的反饋抑制作用，因此，β-葡萄糖苷酶對纖維二糖的高效水解能力對纖維素的徹底降解起到至關重要的作用。另一方面，除水解活性，β-葡萄糖苷酶還具有轉糖苷活性，在一定的條件下可以通過轉糖苷作用將兩個葡萄糖分子合成一個槐糖分子，而已經發現槐糖是纖維素酶基因表達的強誘導物。一般認為絲狀真菌中纖維素酶合成的誘導機制是：存在于分生孢子和菌絲表面的少量組成型纖維素酶首先降解纖維素生成纖維二糖等寡糖，然后在質膜結合的葡萄糖苷酶的轉糖苷作用下，生成槐糖等誘導物，經細胞膜上的組成型透性酶系統進人細胞內，啟動纖維素酶的合成。由此可見，提高β-葡萄糖苷酶在纖維素降解體系的催化活性，對于提高纖維素降解體系轉化效率及降低纖維素乙醇產業生產成本，具有巨大的商業價值和現實意義。

β-葡萄糖苷酶在傳統產業中的應用。β-葡萄糖苷酶底物專一性差異很大，除了作用于纖維二糖及纖維糊精而在纖維素產乙醇產業方面發揮重要作用外，還可作用于芳基葡萄糖苷(如熊果甙、水楊苷及生色化合物p-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷)、烷基葡萄糖苷(甲基-β-D-葡萄糖苷)及β-1，3-葡萄糖苷(昆布二糖)等。因此在其他領域的應用也非常廣泛。例如在食品行業中，由于它能將水果中糖苷前體的芳香族化合物釋放變為具有濃郁香味的化合物，從而改善茶葉、果汁和果酒的風味，因此其作為特殊的風味酶已得到廣泛應用；在醫藥保健品行業中，β-葡萄糖苷酶可通過生物轉化功能，將某些廣泛存在的天然產物轉化為在自然界稀有甚至不存在的物質。例如，β-葡萄糖苷酶可將無活性的結合型大豆異黃酮轉化為具有生理活性的游離型苷元，進而發揮改善更年期綜合癥、預防骨質疏松、抗氧化等生物學功能等。

β-葡萄糖苷酶的研究歷史。β-葡萄糖苷酶廣泛存在于自然界中許多植物和微生物體內。由于植物來源的β-葡萄糖苷酶活性遠比微生物來源要低，所以其分離主要集中在微生物上。起初人們主要從純培養微生物中分離，如木霉、青霉、黑曲霉等。隨著元基因組學技術的興起，人們意識到占自然界中微生物種類99％以上的微生物實際上未可培養，而其中必然蘊藏著豐富的基因資源，所以越來越多的研究者開始將目光集中到纖維素被活躍降解的各種環境系統上，通過構建和篩選各種環境樣品的未培養微生物宏基因組文庫獲得具有不同優良生化性質的β-葡萄糖苷酶新基因，如Walter等人構建鼠大腸未培養微生物的BAC基因文庫，并克隆到一個β-葡萄糖苷酶基因(Walter等，Appl?Environ?Microbiol，71：2347-2354，2005)；Ferrer等人構建了奶牛的瘤胃內容物的宏基因組文庫，從中克隆到包括9個內切葡聚糖酶基因和1個β-葡萄糖苷酶基因(Ferrer?M等，Environ?Microbiol，7：1996-2010，2005.)；Feng等人報道從兔子盲腸未培養微生物中克隆和鑒定了4個內切葡聚糖酶和7個β-葡萄糖苷酶基因C(Feng?Y等，Appl?Microbiol?Biotechnol，75：319-328，2007)；唐咸來等人從沼氣池宏基因組文庫中克隆和鑒定了一個β-葡萄糖苷酶基因等。