[發(fā)明專利]一種山羊朊病毒基因敲除方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110213801.2
• 申請(qǐng)日: 2011-07-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102277356A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李擁軍;李太坤;李文婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/85;C12R1/93
• 代理公司: 南京知識(shí)律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種山羊朊病毒基因敲除方法。

背景技術(shù)

朊病毒又稱Prion蛋白，它是一組至今不能查到任何核酸、對(duì)各種理化作用具有很強(qiáng)抵抗力、具傳染性、分子重量在27?000-30?000道爾頓的蛋白質(zhì)浸染顆粒，它們是在人和動(dòng)物中引起可傳遞海綿腦病的特殊病因。在特定條件下，蛋白質(zhì)發(fā)生突變或構(gòu)型變化，致使由良性變?yōu)閻盒裕醋優(yōu)榫哂袀魅拘缘慕绢w粒，可引起人和動(dòng)物腦內(nèi)神經(jīng)元空泡變性（即海綿狀變性），所以這類病毒引起的疫病被稱為傳染性海綿狀腦病（TSE），又稱為朊病毒病。目前已知由Prion蛋白引起的人畜共患性傳染病約有30余種，其中包括人類朊病毒病：如庫(kù)魯(kuru)病、克雅病(creutzfeldt-Jakob?disease，CJD)、吉斯綜合征(gerstmann-straussler?syndrome，GSS)、致死性家族失眠癥(fatal?familia?insomnia，F(xiàn)FI)等；動(dòng)物朊病毒病：如瘋牛病(madcowdisease，MCD)、綿羊瘙癢癥(scrapie?of?sheep)、山羊瘙癢癥(scrapie?of?goats)、傳染性水貂腦病(transmissible?mink?encephalopa-thy，TME)、糜鹿慢性消瘦病(chronic?wasting?disease，CWD)、貓海綿腦病(feline?spongiformencephalopathy，F(xiàn)SE)等。

隨著第一種被人類認(rèn)知的朊蛋白疾病羊癢病(scrapie)在英國(guó)的出現(xiàn)，至今朊蛋白疾病已經(jīng)存在200多年，而且可以感染不同種屬動(dòng)物的朊蛋白疾病仍在陸續(xù)出現(xiàn)，對(duì)人類的健康造成了巨大的威脅，但其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。朊病毒病至今尚無(wú)有效療法，90%病例均在一年內(nèi)死亡，故在朊病毒病治療方面各國(guó)進(jìn)行了大量的研究。朊病毒的研究不僅具有重大的理論意義，而且具有重大的應(yīng)用價(jià)值。進(jìn)一步揭示朊病毒疾病的機(jī)理，可以使人們更深入地認(rèn)識(shí)朊病毒疾病，進(jìn)而有效地預(yù)防、控制和治療朊病毒疾病。同時(shí)，對(duì)該病的研究有助于探索其他神經(jīng)進(jìn)行性紊亂疾病的病因和病理，如阿爾茨海默氏病、帕金森病和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化等疾病的研究與治療。

由于致病因子Prion的特殊性，使人們對(duì)朊蛋白疾病的防控研究相對(duì)局限。但目前多種體外合成生物技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用，為人們提供了一個(gè)新的途徑去接近Prion的致病機(jī)理，為防治朊蛋白疾病提供豐富的研究資源。RNA干擾技術(shù)，則是可以進(jìn)行研究利用的一個(gè)重要手段。

RNA干擾（RNA?interference，?RNAi）是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活性及基因表達(dá)的監(jiān)控機(jī)制，是指內(nèi)源性或外源性與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA存在同源互補(bǔ)序列的雙鏈RNA?（double-stranded?RNA，?dsRNA），在細(xì)胞內(nèi)特異地降解該mRNA，從而致使特異性的基因有效封閉的過(guò)程。由于這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional?gene?silencing，PTGS）。研究中導(dǎo)入的雙鏈RNA多為21-23nt的小分子干擾RNA片段（small?inter-fering?RNAs，簡(jiǎn)稱siRNAs，又稱引導(dǎo)RNAs），引起的RNAi效應(yīng)較強(qiáng)。

由于RNAi可以作為一種簡(jiǎn)單、有效的代替基因敲除的遺傳工具，它正在基因表達(dá)調(diào)控和基因功能研究中發(fā)揮重要作用。目前，RNAi已發(fā)展成為一種廣泛的、用于產(chǎn)生遺傳敲除的技術(shù)，并且用于通過(guò)反向遺傳學(xué)研究基因功能。RNAi技術(shù)作為一個(gè)強(qiáng)有力的反向遺傳學(xué)工具，不僅提供了高效、特異性的抑制基因表達(dá)的手段，而且正成為基因功能研究、抗病毒感染研究和基因治療研究的重要技術(shù)方法。目前應(yīng)用RNA干擾技術(shù)嘗試抗病毒治療研究正成為傳染病學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。抗病毒治療研究的主要原理是通過(guò)抑制病原體本身的復(fù)制及翻譯，或抑制某些與病毒感染有關(guān)的內(nèi)源性基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)治療目的。目前多數(shù)的研究是通過(guò)直接合成特異的siRNA以降解病毒RNA或其mRNA，也有通過(guò)RNAi抑制參與病毒復(fù)制過(guò)程的宿主細(xì)胞的某些基因的表達(dá)而發(fā)揮抗病毒作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種特異的siRNA以特異性降低山羊朊病毒mRNA水平。

本發(fā)明所述的山羊朊病毒特異siRNA，其正義鏈序列如SEQ?ID?NO.1所示，反義鏈序列如SEQ?ID?NO.2所示。

本發(fā)明還提供了一種山羊朊病毒基因敲除方法，是將上述山羊朊病毒特異siRNA

通過(guò)載體導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，降低山羊朊病毒mRNA水平。