[發(fā)明專利]重組人神經(jīng)生長因子缺失突變體及其制備方法和用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110213670.8
• 申請日: 2011-07-28
• 公開（公告）號: CN102898514A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳薇;侯利華;宋小紅;于婷;付玲;于蕊;房婷
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所
• 主分類號: C07K14/48
• 分類號: C07K14/48;C12N15/12;C12N15/10;C12N15/79;C12N5/10
• 代理公司: 北京汲智翼成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11381
• 代理人: 陳曦;郭亞芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種突變體，具體的說是一種在真核表達系統(tǒng)中高效表達并保持相似的生物學活性的重組人神經(jīng)生長因子缺失突變體。

背景技術(shù)

神經(jīng)生長因子(Nerve?Growth?Factor，NGF)是Levi-Montlcini于1953年在小鼠肉瘤細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一個神經(jīng)營養(yǎng)因子，NGF能夠維持和促進交感神經(jīng)及來自神經(jīng)嵴的感覺神經(jīng)細胞的存活、分化和成熟以及執(zhí)行功能，是參與損傷神經(jīng)再生和功能修復的重要因素。

NGF存在于多種物種中，在雄性小鼠頜下腺、牛精漿、蛇毒、豚鼠前列腺和人胎盤中組織中含量豐富。其中小鼠NGF與人NGF氨基酸序列同源性達到90％。利用生物技術(shù)提取自小鼠頜下腺的鼠NGF及提取自人胎盤組織的人NGF注射液目前已在中國上市，臨床上主要用于治療視神經(jīng)損傷等，例如中毒性周圍神經(jīng)損傷、外傷性周圍神經(jīng)損傷、面神經(jīng)炎等疾病。考慮到鼠NGF應(yīng)用于人體的種屬差異性及小鼠作為原材料所具有的潛在的致病因子風險及人胎盤組織原材料的限制，發(fā)展基因工程技術(shù)制備重組人NGF(rhNGF，recomb?inant?human?NGF)來取代提取的鼠NGF和人NGF具有很好的應(yīng)用前景。

人體內(nèi)成熟的NGF以同源二聚體的形式存在，每條肽鏈包含120個氨基酸。人NGF基因位于1號染色體短臂上，完整的NGF外顯子由241個氨基酸組成，通常稱為prepro?NGF前體，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中prepro?NGF前體的信號肽被切割下來，形成pro?NGF前體(223個氨基酸)，pro?NGF前體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中以同源二聚體形式存在，然后轉(zhuǎn)移至高爾基體中，前體部分經(jīng)Furin酶切，形成成熟的NGF二聚體(單體含有120個氨基酸)，被轉(zhuǎn)運至細胞外，同時也有部分未經(jīng)切割的pro?NGF前體分泌至細胞外。

提取自小鼠頜下腺的鼠NGF通常在N端、C端有一些氨基酸缺失，例如N端缺失8個氨基酸、C端缺失2個或3個氨基酸，這幾種缺失突變體同時存在于鼠NGF中，有研究表明N端或C端缺失的NGF并不影響其生物學活性。在利用真核細胞制備rhNGF時，同樣發(fā)現(xiàn)經(jīng)常存在C端缺失2到3個氨基酸的情況，會形成同源或者異源二聚體，例如120/120、118/118、117/117、120/118、117/118等，這就給rhNGF的質(zhì)量控制造成了一定的困擾。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種在真核細胞中高效表達的重組人神經(jīng)生長因子缺失突變體。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

一種重組人神經(jīng)生長因子缺失突變體，所述突變體是完整人神經(jīng)生長因子肽鏈C端缺失3個氨基酸；所述突變體氨基酸序列為：

(1)如序列表SEQ?ID?No.1所示。或

(2)所述突變體的氨基酸序列為與SEQ?ID?No.1中所示的氨基酸序列具有95％以上同源性且具有神經(jīng)生長因子生物學活性的氨基酸序列。

編碼上述重組人神經(jīng)生長因子缺失突變體的基因。

所述基因如SEQ?ID?No.2所示。

一種制備重組人神經(jīng)生長因子缺失突變體基因的方法，所述步驟如下：根據(jù)人NGF?DNA序列(Genbank：NM_002506)設(shè)計引物，分離人外周血白蛋白，提取其總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此cDNA為模板，擴增人NGF基因及缺失突變體基因。

一種表達載體，所述載體含有上述方法制備得到的基因。

所述表達載體為真核表達載體。真核細胞可以使用酵母細胞、昆蟲細胞、植物細胞、哺乳動物細胞等，基因?qū)爰毎姆椒梢允褂梅€(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時轉(zhuǎn)染。

一種含有上述表達載體的宿主細胞。

所述宿主細胞為哺乳動物細胞。所述哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢細胞、人胚腎293細胞、COS細胞或Hela細胞。

一種表達上述載體的方法，是將含有重組人神經(jīng)生長因子缺失突變體基因的表達載體轉(zhuǎn)化至宿主細胞，培養(yǎng)所得重組細胞表達得到重組人神經(jīng)生長因子缺失突變體。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明所述的突變體采取表達C末端缺失3個氨基酸rhNGF(rhNGF-D3)的策略來保持rhNGF的C末端完整性，并且通過此改造，相比較于rhNGF，在真核細胞中rhNGF-D3蛋白表達水平提高5～10倍，生物活性保持不變，蛋白C端均一。

本發(fā)明的可實施性和突出實質(zhì)性特點以及積極效果可通過以下實例得以體現(xiàn)，但不限制其范圍。

附圖說明