[發明專利]一種JC病毒的檢測方法、其試劑盒及應用

無效

• 申請號: 201110211891.1
• 申請日: 2011-07-27
• 公開（公告）號: CN102690895A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 石炳毅;錢葉勇;蔡明;宋玉亮;韓永;王新穎;范宇;解俊杰;葉鋒
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三〇九醫院;北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 北京元中知識產權代理有限責任公司 11223
• 代理人: 王明霞

1.一種JC病毒的檢測方法，包括以下步驟：

首先針對JC病毒基因組設計特異性引物JCV-F和JCV-R，Taqman熒光探針JCV-P，Taqman熒光探針JCV-P的5’端標記有熒光基團，在除5’端外的任意一個位置上標記有淬滅基團，優選連接于3’端；

然后，處理待測樣本，加入所述的特異性引物及探針進行PCR反應；

最后通過熒光定量PCR儀檢測，得到反應結果；

其中，JCV-F的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，或由SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；

JCV-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，或由SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；

JCV-P的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示，或由SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。

2.根據權利要求1所述的JC病毒的檢測方法，其特征在于，所述的Taqman熒光探針的熒光報告基團選自由6-羧基熒光素、六氯-6-甲基熒光素、VIC熒光染料、四氯-6-羧基熒光素、羧基-X-羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明、磺酰羅丹明、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯、花菁3、花菁5或花菁5.5中的至少一種；

所述熒光淬滅基團選自6-羧基四甲基羅丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬滅劑1、黑洞淬滅劑2或黑洞淬滅劑3中的至少一種；

3.根據權利要求2所述的JC病毒的檢測方法，其特征在于，

當熒光淬滅基團選自4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸時，熒光報告基團選自6-羧基熒光素、四氯-6-羧基熒光素、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯、六氯-6-甲基熒光素、花菁3中的至少一種；

當熒光淬滅基團選自6-羧基四甲基羅丹明時，熒光報告基團選自6-羧基熒光素、四氯-6-羧基熒光素、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯或六氯-6-甲基熒光素中的至少一種；

當熒光淬滅基團選自黑洞淬滅劑1時，熒光報告基團選自6-羧基熒光素、四氯-6-羧基熒光素、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯、六氯-6-甲基熒光素或花菁3中的至少一種；

當熒光淬滅基團選自黑洞淬滅劑2時，熒光報告基團選自6-羧基四甲基羅丹明、花菁3、羧基-X-羅丹明或磺酰羅丹明中的至少一種；

當熒光淬滅基團選自黑洞淬滅劑3時，熒光報告基團選自花菁5或花菁5.5中的一種；

優選的，所述熒光報告基團為6-羧基熒光素；所述熒光淬滅基團為黑洞淬滅劑1。

4.根據權利要求1所述的JC病毒的檢測方法，其特征在于，步驟(2)中PCR反應的反應體系為：PCR反應液19.8μl、DNA聚合酶0.2μl和待檢模板5.0μl；

其中，PCR反應液的組成為：10×反應緩沖液2.5μl，JCV-F(10μM)0.60μl，JCV-R(10μM)0.30μl，JCV-P(10μM)0.70μl，dNTP3.0μl，最后用無菌超純水將反應體系補至19.8μl。

5.根據權利要求1所述的JC病毒的檢測方法，其特征在于，步驟(2)中PCR反應的反應條件為：92～95℃保溫3～5分鐘后；92～95℃，10～15秒，55～65℃，10～35秒，共35～45個循環；優選為：94℃保溫4分鐘后；94℃，15秒，60℃，35秒，共40個循環。

6.根據權利要求1所述的JC病毒的檢測方法，其特征在于，步驟(2)中的PCR反應中，還設置陰性質控組和JC病毒定量標準品I～IV組；其中，陰性質控組的待測模板為純水，JC病毒定量標準品I～IV的待測模板分別為JCV定量標準品I、JCV定量標準品II、JCV定量標準品III、JCV定量標準品IV。