[發(fā)明專利]腸出血性大腸桿菌stx1基因檢測試劑盒及其使用方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110211370.6
• 申請日: 2011-07-27
• 公開（公告）號: CN102251044A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陸曄;田楨干;王傳現(xiàn);章琪;盧鐘山;曹以誠;杜正平;陳洵;譚慧媚
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州華峰生物科技有限公司;中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/19
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;鄭泓

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測試劑，具體涉及一種腸出血性大腸桿菌stx1基因檢測試劑盒及其使用方法。

背景技術(shù)

2011年5月德國爆發(fā)腸出血性大腸桿菌（EHEC）感染疫情，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報道，截止6月5日，德國已報告630例HUS病例，死亡15例；1601例EHEC感染病例，死亡6例。此外，歐洲奧地利、捷克、瑞典、丹麥、荷蘭、波蘭、法國、瑞士、挪威、西班牙、盧森堡和英國等12國共報道31例HUS（死亡1例）和EHEC感染病例73例。美國報道2例HUS病例。

腸出血性大腸桿菌感染是一種人畜共患病，主要引起腹部絞痛和輕度腹瀉，一些病例為血性腹瀉（出血性腸炎）。多數(shù)病人10天內(nèi)康復，少數(shù)病人特別是幼兒和老年人，可出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥，如以急性腎功能衰竭、溶血性貧血和血小板減少為特點的溶血尿毒綜合癥（HUS）。一般5%~10%的EHEC感染者可發(fā)展為溶血尿毒綜合癥，病例死亡率為3%至5%。

EHEC致病主要依靠分泌毒素來使人體受到損害。EHEC產(chǎn)生的毒素能使vero細胞產(chǎn)生病變，故稱vero毒素；又因與志賀菌的毒素在生物學特性、物理特性和抗原性等方面相似，亦稱志賀樣毒素（shiga-liketoxin，SLT）或志賀毒素（stx）。志賀毒素在腸道中能夠殺傷上皮細胞，并引起嚴重的炎癥反應(yīng)和廣泛的組織病理學損傷，從而導致血痢或無血性腹瀉。

EHEC是大腸桿菌的一個亞型，O157:H7是EHEC的主要血清型，此外還包括O26、O111、O103、O113、O117、O128等四十多個血清型，此次引起德國EHEC感染疫情的主要為O104：H4血清型。鑒于EHEC危害的嚴重性以及覆蓋血清型的廣泛性，因此準確、快速檢測腸出血性大腸桿菌具有十分重要的意義。

傳統(tǒng)腸出血性大腸桿菌檢測方法，由于其檢測周期長、程序復雜、所需試劑繁多等缺點已遠遠不能滿足現(xiàn)代檢測要求。以聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)為代表的病原核酸檢測技術(shù)在實際應(yīng)用中存在一些問題，如普通聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點。而熒光實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（real?time?PCR）技術(shù)雖然較好地解決了交叉污染的問題，并簡化了操作過程，但卻需要更復雜的定量測定儀器，因此不適用于現(xiàn)場快速檢測。而且實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)PCR技術(shù)中熒光探針的成本較高，加大了推廣應(yīng)用的難度。免疫學檢測技術(shù)快速簡便成本低廉，但要求高質(zhì)量高穩(wěn)定性的單克隆抗體，否則因準確性不夠，目前只能是輔助檢測手段。所以及時運用生物技術(shù)發(fā)展的最新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高具有重要意義。其中恒溫擴增（Isothermal?Amplification）核酸快速檢測技術(shù)是病原核酸檢測技術(shù)上的長足進步，現(xiàn)已建立起來的環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)（LAMP）具有很多的優(yōu)越性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種檢測效果更全面、特異性高、漏檢率低的腸出血性大腸桿菌檢測試劑盒。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)措施實現(xiàn)：一種腸出血性大腸桿菌stx1基因檢測試劑盒，所述的腸出血性大腸桿菌stx1基因檢測試劑盒包括以stx1基因為靶基因、基于環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)設(shè)計的兩對引物：內(nèi)引物FIP/BIP和外引物?F3/B3。

志賀毒素由原噬菌體所編碼，它由?A、B?2個亞單位組成，stx-A為RNA-?N-糖苷酶（RNA-?N-?glucosidase）催化亞單位，是毒素的毒力區(qū)。stxB?為靶受體結(jié)合區(qū)，可以激發(fā)機體的免疫應(yīng)答，是開發(fā)疫苗可選擇的重要靶分子。stx可分成2類即stx1和stx2。本專利檢測的是stx1基因（GeneBank的gi為32400301），具有很高的特異性。

作為本發(fā)明腸出血性大腸桿菌stx1基因檢測試劑盒的優(yōu)選實施方式，所述的兩對引物為

外引物F3（1）：（SEQ?ID?NO?1）

GTAGATTCGCTGAATGTCATT

外引物B3（1）：（SEQ?ID?NO?2）

TGTTAACAAATCCTGTCACAT

內(nèi)引物FIP（1）：（SEQ?ID?NO?3）

TCAATCATCAGTAAAGACGTACCTCTTTTCGCTCTGCAATAGGTACT

內(nèi)引物BIP（1）：（SEQ?ID?NO?4）

CAGGGGATAATTTGTTTGCAGTTGATTTTCGTTCAACAATAAGCCGTAGA?

或