[發明專利]一種以重樓根莖為外植體的愈傷組織培養方法

有效

• 申請號: 201110211068.0
• 申請日: 2011-07-26
• 公開（公告）號: CN102301957A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發明（設計）人: 田夢良;王躍華;付偉;李文光;蔣亭亭;楊軍;張玨;張紅玉;陳燕;王勇
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 成都科奧專利事務所(普通合伙) 51101
• 代理人: 王蔚

技術領域

本發明涉及一種重樓組織培養方法，特別是涉及一種以重樓根莖為外植體的愈傷組織培養方法。

背景技術

重樓是名貴中藥材之一，全世界共有24種，我國擁有19種，其中又以西南地區各省的種類和資源尤為豐富，如云南、四川、貴州等地。重樓主要有效成分是甾體皂苷，其苷元主要為異螺甾烷醇類的薯蕷皂苷元和偏諾皂苷元，并含有氨基酸、甾酮、蛻皮激素、黃酮苷等化合物?，F代藥理研究表明，重樓具有抗腫瘤、止血、止咳平喘、抗菌、抗病毒等作用，其良好的療效已被眾多的制藥工業用于藥劑的使用，是云南白藥、宮血寧、熱毒清等重要中成藥的主要成分。

隨著中醫藥產業的快速發展，重樓藥材的需求正以每年20％的幅度遞增，而其野生資源卻逐年減少，導致重樓價格迅速上漲，嚴重制約了制藥企業的產量和質量。當前，重樓主要靠采挖野生資源，由于長期過度采挖，并缺乏對其生態環境的保護，致使野生重樓資源遭到了毀滅性的破壞，現已瀕臨滅絕。

當前重樓主要是靠種子和根莖進行繁殖，由于重樓種子存在種胚發育不完全，胚乳堅硬，胚軸后熟等明顯“雙重休眠”特性，因此重樓種子在播種后通常需要經歷兩個冬天才能萌發成苗，是典型的“二年生種子”，而且在自然狀態下重樓種子出苗率很低、生長周期長，從出苗到成材需要8～10年的時間；而使用重樓根莖進行營養繁殖，由于重樓根莖本身就是其藥用有效部位，因此利用根莖切塊生產重樓種苗存在用種量大、生產成本高等問題。

利用組織培養技術生產藥用植物具有生長周期短，繁殖率高、能有效降低災害性氣候對植物生長的不利影響等優點，可進行周年培養生產，且培養條件優越，對植物生長極為有利；因此應用組織培養方法進行重樓植物的快速繁殖是解決當前重樓藥材短缺和更好地保護其野生植物資源的有效方法。

到目前為止，重樓植物的組織培養研究還未取得令人滿意的結果，僅有少數成果報道。四川師范大學學報(自然科學版)第29卷第1期(2006年1月)刊登了李群等人撰寫的《重樓屬植物愈傷組織的誘導和培養》，文中作者以重樓植物的不同部位作為外植體進行了愈傷組織誘導培養，發現重樓根和葉片不能誘導出愈傷組織，而根莖、子房和幼芽可不同程度地誘導出愈傷組織，但實驗結果顯示根莖形成的愈傷組織易纖維化，不具備增殖能力，另外，他們發現倒苗期的根莖很難誘導產生愈傷組織。

發明內容

本發明的目的在于提供一種以重樓根莖為外植體的愈傷組織培養方法，該方法可實現以倒苗期重樓根莖為外植體對愈傷組織的有效誘導和快速增殖。

為達到上述目的，本發明采用的解決方法包括下列步驟：

(1)外植體的選取：選取倒苗期重樓的根莖，用刀將根莖帶芽的前兩個節段切下，用草木灰處理切下段的切口后將切下段移栽于腐質土中，待其有新根長出時，挖出移栽體，作為外植體備用；

(2)外植體的消毒：用流水洗凈外植體表面的泥土及污物，再將洗凈后的外植體放入消洗靈溶液中浸泡10～30min，然后將浸泡后的外植體用流水沖洗2～4h后取出晾干，將晾干后的外植體轉入超凈工作臺，先用濃度為0.1％～0.2％的升汞消毒6～20min，然后用無菌水沖洗3～6次，再用已滅菌的濾紙吸干其上的水分；

(3)愈傷組織的誘導培養：切去外植體前端的芽體，將修剪后的外植體接入愈傷組織誘導培養基1/2MS+6-BA0.5～2mg·L^-1+NAA?0～1.0mg·L^-1+IAA?0～3mg·L^-1+蔗糖30～50g·L^-1+瓊脂6.0～7.0g·L^-1中進行培養；

(4)愈傷組織的增殖培養：將步驟(4)培養后的愈傷組織轉接入增殖培養基MS+6-BA?0.5～2mg·L^-1+NAA?0.1～1mg·L^-1+2.4-D?0～2mg·L^-1+蔗糖30～50g·L^-1+瓊脂6.0～7.0g·L^-1中進行培養；

上述所有培養基的pH值為5.6～6.5、培養溫度18～28℃、每天光照8～16小時、光照強度為1000～1800lx。

目前重樓植物的組織培養仍未取得滿意效果，其主要原因是在外植體的選擇和進行有效誘導培養上仍未有明顯突破。