[發(fā)明專利]一種千層塔原葉體誘導(dǎo)和增殖方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110206745.X
• 申請日: 2011-07-22
• 公開（公告）號: CN102283129A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭斌;尉亞輝;包日雙;徐玲玲
• 申請（專利權(quán)）人: 西北大學(xué)
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 西安恒泰知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 61216
• 代理人: 李鄭建

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種千層塔原葉體誘導(dǎo)和增殖方法。

背景技術(shù)

千層塔為石杉科（Huperziaceae）石杉屬（Huperzia?Bernh.）植物蛇足石杉（Huperzia?serrata（Thunb.）Trevis）的全草，異名：虱子草、矮杉樹、虱婆藥。千層塔始載于《植物名實圖考》，性味辛、苦、平。具有散瘀消腫、解毒和止痛的功效。1972年我國科技工作者報道了從該植物中分離的石杉堿甲具有橫紋肌松弛作用，之后的大量研究發(fā)現(xiàn)石杉堿甲是一種高效、低毒、可逆和高選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑。由于千層塔所具有的顯著醫(yī)療作用和潛在的市場效益，其野生資源迅速減少。世界各國同行從不同的角度對這一重要藥用植物資源進(jìn)行研究。

自然環(huán)境中千層塔生活史包括兩種繁殖方式，一種是通過孢子進(jìn)行繁殖。孢子萌發(fā)后屬地下生配子體，需6~15年才能成熟。成熟的配子體即塊狀體，其上產(chǎn)生精子器和卵子器。在水環(huán)境中，卵子和精子結(jié)合形成胚，再發(fā)育成孢子體。孢子體是千層塔作為藥用植物的原植物形式。孢子體的根生于莖的基部，為不定根。不定根和真菌共生，其真菌的菌絲侵入根的皮層細(xì)胞間隙中，而不侵入細(xì)胞內(nèi)，為外生菌根。共生真菌的菌絲起到了根毛的功能，增加根系的吸收面積。自然界中千層塔的另一種繁殖方式是芽孢繁殖，但這種方式在野外極少發(fā)現(xiàn)。因此，千層塔野生資源的再生受到了極大限制。

利用植物組織培養(yǎng)可進(jìn)行珍稀和瀕危藥用植物的微繁殖，建立高效和穩(wěn)定培養(yǎng)系，培育出脫毒的優(yōu)質(zhì)品種，解決珍稀瀕危藥用植物人工種植存在的種子稀少、種苗奇缺、種質(zhì)退化等嚴(yán)重問題，保存野生藥用植物資源和基因多樣性，為藥用植物的可持續(xù)利用提供技術(shù)手段。

但是，千層塔組織培養(yǎng)過程主要采用的是根、莖、葉。這些外植體存在外植體滅菌困難、無菌外植體獲得率低，外植體接種后污染和褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，不能生長、分化和增殖等問題。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷或不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種千層塔原葉體誘導(dǎo)和增殖方法，該方法以孢子囊或孢子作為外植體，進(jìn)行離體組織培養(yǎng)，為千層塔的快速繁殖建立技術(shù)基礎(chǔ)。

為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案：

一種千層塔原葉體誘導(dǎo)和增殖方法，其特征在于，具體按以下步驟操作：

（1）外植體的選擇

從野外采集蛇足石杉的孢子囊，經(jīng)自來水沖洗干凈；

（2）外植體的表面滅菌

將洗干凈的孢子囊在超凈工作臺中先浸在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液中30s~60s；接著置于濃度0.1%的HgCl₂溶液中浸泡5min~8min，再用無菌水沖洗3-5次，將孢子囊或者孢子囊破裂后從中散出的孢子作為千層塔原葉體誘導(dǎo)的外植體；

（3）原葉體的誘導(dǎo)培養(yǎng)

將得到的外植體接種在原葉體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度為22±2℃、光照時間12/d~16/d、光照強度為300?Lx~2000?Lx條件下培養(yǎng)10-12周，從外植體上長出綠色的原葉體組織；

（4）原葉體的增殖

將步驟（3）中獲得的原葉體組織切割成0.2cm²~0.5cm²的小片，然后轉(zhuǎn)入原葉體增殖培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與步驟（3）中相同，培養(yǎng)6周后，獲得大量的新增殖的原葉體。

所述原葉體誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為：在常規(guī)的MS培養(yǎng)基中加入3-吲哚丁酸0.2mg/L~2mg/L。

所述原葉體增殖培養(yǎng)基組成為：在常規(guī)的MS培養(yǎng)基中加入2，4-二氯苯氧乙酸0.2mg/L~1mg/L，以及6-芐氨基嘌呤0.5mg/L~2mg/L?。

采用本發(fā)明的千層塔原葉體誘導(dǎo)和增殖的方法，帶來的技術(shù)效果體現(xiàn)在以下幾方面：

1、選取千層塔[Huperzia?serrata?（Thunb.）Trev.]的孢子囊或孢子作為外植體，由于孢子囊或孢子與根、莖或葉片相對比，對外植體除菌較容易，因此，很容易建立千層塔的無菌組織培養(yǎng)體系，從而避免了外植體滅菌困難、無菌外植體獲得率低，外植體接種后污染和褐化現(xiàn)象嚴(yán)重的問題。

2、通過對孢子囊或孢子培養(yǎng)，比較容易獲得原葉體，原葉體在人工培養(yǎng)基上很容易實現(xiàn)增殖，從而克服了傳統(tǒng)千層塔組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的外植體不能生長、分化和增殖等問題。

3、通過控制光照強度很容易控制原葉體的增殖倍數(shù)，為通過原葉體進(jìn)行千層塔大規(guī)模繁殖建立重要的技術(shù)基礎(chǔ)。

具體實施方式