[發明專利]快速分離人Foxp3+ Treg細胞的方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201110206170.1
• 申請日: 2008-10-10
• 公開（公告）號: CN102277331A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: O·倫特茲什科;K·法爾克;M·克萊因維特菲爾德
• 申請（專利權）人: 分子醫學馬克斯德爾布呂克中心
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 王健

本申請為2010年05月31日提交的申請號為2008801185258標題為“快速分離人Foxp3+Treg細胞的方法和試劑盒”的申請的分案申請?

本發明涉及從樣品中分離人forkhead?box?P3(Foxp3+)CD4+調節性T細胞(在本文稱作Foxp3+Treg細胞)的方法，所述樣品含有(i)外周血單個核細胞(PBMC)，(ii)含有淋巴細胞的液體或者(iii)含有淋巴細胞的組織；本發明還涉及分離人Foxp3+Treg細胞的試劑盒以及抗CD49d抗體在分離人Foxp3+Treg細胞中的應用。?

背景技術

Foxp3+調節性T細胞或者“Treg”是控制多種免疫應答的基礎，其中Treg可迅速抑制其它免疫細胞的活性。特別地，Treg通過下調對自身和非自身抗原的非所需免疫應答而對于維持耐受性是至關重要的(見例如Fontenot，J.D.&Rudensky，A.Y.Nat?Immunol?6，331-7(2005)；Sakaguchi，S.，Annu?Rev?Immunol?22，531-62(2004))。例如，在多發性硬化癥(MS)、1型糖尿病(T1D)、銀屑病、重癥肌無力(MG)及其它自身免疫疾病的患者中已發現Treg缺陷(Baecher-Allan，C.&Haller，D.A.，Immunol?Rev?212，203-16(2006))。在特異反應性和過敏性疾病中也存在類似關聯(Robinson，D.S.，Larche，M.&Durham，S.R.，J?Clin?Invest?114，1389-97(2004))。對于所有這些疾病均存在指向患者Treg細胞的降低的體外免疫抑制的報道。這已導致對于在治療或者預防慢性感染、自身免疫疾病、過敏和移植相關并發癥如移植物排斥或者移植物抗宿主疾病的免疫治療中使用Treg的可能性的日益增長的興趣(GvHD)(見Roncarolo，M.G.&Battaglia，M.，Nat?Rev?Immunol?7，585-98(2007)中的綜述)。?

在人和嚙齒動物中，Treg細胞組成了大約2-10％的CD4+T細胞并組成性表達CD25、CTLA-4和GITR以及參與其發育和功能的轉錄因子Foxp3。Treg細胞的特征性標記是Foxp3。用于分離人Foxp3+Treg細胞的方法是已知的。例如，Hoffmann，P.et?al.Biol?Blood?Marrow?Transplant?12，267-74(2006)中描述了在優質生產規范(GMP)條件下通過使用兩步磁性細胞分離方案從標準白細胞采集物(leukapheresis)產物中分離具有調節功能的CD4+CD25+?T細胞。所產生的細胞產物含有平均49.5％的Foxp3+Treg細胞。而且，商業試劑盒如Miltenyi?Biotec的CD4+CD25+調節性T細胞分離試劑盒或者Invitrogen的DynalCD4+CD25+Treg試劑盒也是可用的。?

迄今為止所描述的所有分離人Foxp3+Treg細胞的方法均使用基于Treg細胞表面標記的對Foxp3+Treg細胞的陽性選擇(見例如Seddiki，N.et?al.，J?Exp?Med?203，1693-700(2006))。也就是說，通過使用與Treg相關的細胞表面標記主要是CD25的抗體來分離Foxp3+Treg細胞。但是大多數Treg細胞表面標記如CD4和CD25并非局限于Treg。例如，常用的CD25并不是在所有Foxp3+Treg細胞上均存在，其在效應和記憶CD4+T細胞上也表達(見例如Baecher-Allan，C，Brown，J.A.，Freeman，G.J.&Hafler，D.A.，J?Immunol?167，1245-53(2001))。因此，上述這些陽性選擇方法不能分離占Foxp3+Treg細胞大多數的均一細胞群；Hoffmann，P.等獲得平均49.5％的Foxp3+Treg細胞。?

目前方法的另一缺點是分離的Treg亞群中有效應T細胞的污染。后者代表有害反應的固有風險，因其通過分泌細胞因子如IFN-γ或者IL-17來驅動促炎免疫反應。當采用標記如CD25時，這些污染可以嚴重到高達一半的所分離的CD4+細胞群包括效應T細胞(Hoffmann，P.et?al.Biol?Blood?Marrow?Transplant?12，267-74(2006))。?