[發(fā)明專利]基于EST-SSR標(biāo)記的草魚分類方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110205243.5
• 申請(qǐng)日: 2011-07-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102242222A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-11-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于凌云;白俊杰;王解香;樊佳佳;全迎春;李勝杰;馬冬梅;葉星
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強(qiáng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種魚類的分類方法，特別涉及一種基于EST-SSR標(biāo)記的草魚分類方法。

背景技術(shù)

草魚(Ctenopharyngodon?idella)具有生長(zhǎng)快、養(yǎng)殖成本低等優(yōu)點(diǎn)，為池塘、湖泊和水庫(kù)的主要養(yǎng)殖對(duì)象，是我國(guó)淡水漁業(yè)中最重要的養(yǎng)殖品種之一。草魚分布在亞洲的各大江河水系，在中國(guó)從黑龍江到西江（除新疆和青藏高原無(wú)自然分布外）都有其分布，形成了草魚復(fù)雜的遺傳背景和豐富的種質(zhì)資源。近年來(lái)，天然水環(huán)境的變化和污染使得自然界草魚種群數(shù)量明顯下降?，生產(chǎn)中近親繁殖導(dǎo)致種質(zhì)退化，已影響到草魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的正常發(fā)展。為有效保護(hù)和利用這一淡水魚類資源，有必要開(kāi)發(fā)和利用分子遺傳標(biāo)記，對(duì)不同水系的草魚群體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，搞清其遺傳背景，為草魚選育種群的選擇奠定基礎(chǔ)。目前，已有學(xué)者采用同工酶、mtDNA-RFLP、微衛(wèi)星等檢測(cè)技術(shù)對(duì)長(zhǎng)江水系草魚種群的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，但對(duì)不同水系之間草魚群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究工作并不多。

表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed?sequence?tag，EST）中存在一定數(shù)量的微衛(wèi)星或簡(jiǎn)單重復(fù)序列（EST-SSR），它不僅具有在基因組中均勻分布、共顯性和實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，而且開(kāi)發(fā)成本較低，已成功應(yīng)用于群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、QTL定位和分子標(biāo)記輔助選擇育種等研究領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種基于EST-SSR標(biāo)記的草魚分類方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

EST-SSR標(biāo)記的草魚分類方法，包括提取草魚的DNA，使用EST-SSR標(biāo)記作為引物進(jìn)行擴(kuò)增；根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果對(duì)草魚進(jìn)行分類，所述的EST-SSR標(biāo)記對(duì)為：???????????????????????????????????????????????。

PCR的反應(yīng)體系為：

ddH₂O??????????????????????????14.9μL

10×PCR?Buffer????????????????????2.0μL

MgCl₂（25?mmol/L）??????????????0.8μL

4×dNTP（10mmol/L）?????????????0.3μL

Taq酶（5U/μL）??????????????????0.2μL

上、下游引物（10μmol/L）?????????0.4μL

模板DNA（40ng/μL）?????????????1.0μL。

PCR的反應(yīng)條件為：

1)???94℃預(yù)變性4min，

2)???94℃變性30s，

3)???退火30s，

4)???72℃延伸45s；

5)???循環(huán)步驟2）～4）30～40次，

6)???72℃延伸7min。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明的方法，可以準(zhǔn)確、快速地鑒定出不同來(lái)源草魚的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳背景，為篩選和建立草魚德育基礎(chǔ)群體提供參考。

附圖說(shuō)明

圖1是根據(jù)群體間的遺傳距離矩陣構(gòu)建5?個(gè)群體的UPGMA聚類圖。

具體實(shí)施方式

本申請(qǐng)人2009年構(gòu)建了草魚腦、肌肉、肝等組織cDNA文庫(kù)，去冗余處理后得到45?318?條EST序列，平均序列長(zhǎng)度為650bp，用?trf（tandem?repeats?finder）軟件從該序列中查找到5?556?個(gè)微衛(wèi)星。選取重復(fù)次數(shù)在5?次以上的雙堿基重復(fù)序列和重復(fù)次數(shù)在4?次以上的三堿基或四堿基重復(fù)序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer??Primer5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，獲得EST-SSR引物118?對(duì)。

本申請(qǐng)人利用獲得118?對(duì)EST-SSR引物對(duì)50?尾草魚樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中87對(duì)引物擴(kuò)增出單一條帶、12?對(duì)引物無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物、19?對(duì)引物能擴(kuò)增出多態(tài)性片段，多態(tài)性引物占所有設(shè)計(jì)引物的16.00%。其中雙堿基重復(fù)序列15?個(gè)，占83.16%；四個(gè)堿基重復(fù)序列4?個(gè)，占16.84%。而雙堿基重復(fù)中以（AC）n/（GT）n為主，占73.33%；（AT）n/（AT）n占13.33%，（CT）n/（AG）n占13.33%。

19對(duì)EST-SSR引物的序列如下：

具體的檢測(cè)方法如下：

模板DNA的提取