[發明專利]一種菊花CVB和CChMVd病毒的二重RT-PCR檢測方法

有效

• 申請號: 201110203309.7
• 申請日: 2011-07-20
• 公開（公告）號: CN102242225A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 陳發棣;尤燕平;陳素梅;蔣甲福;房偉民;管志勇
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

技術領域

本發明涉及分子生物學的病毒檢測領域，具體地說涉及一種菊花CVB和CChMVd病毒的二重RT-PCR檢測方法。

背景技術

菊花（Dendranthema?morifolium?Tzvel.(Chrysanthemum?morifolium?Ramat.)）為菊科菊屬多年生宿根草本植物，是我國十大傳統名花，世界上最早栽培的觀賞植物之一，具有很高的經濟和觀賞價值，在花卉產業中占據重要的地位。菊花在移栽、扦插、以及種植過程中易感染病毒。菊花B病毒（Chrysanthemum?virus?B，CVB），使患病菊花在菊花葉上表現為輕型花葉癥，而對于易感品種，可形成明顯花葉癥狀或壞死斑，嚴重的會產生褐色枯斑。CVB于觀賞菊花上普遍發生，發病率60~65%。菊花褪綠斑駁類病毒（Chrysanthemum?chloritic?mottleviroid，CChMVd）是為害菊花的另一種重要病原，引起菊花斑駁病。受害植株通常在葉上呈現斑駁狀，后完全褪綠。有些品種則表現為生長遲緩矮化，生根不良。

以往檢測植物病毒可用電鏡負染色法進行檢測和鑒定，但是負染色電鏡方法對初學者來講，難度比較大，不僅容易受到破碎細胞的干擾而影響判斷結果，而且不能鑒定潛隱和復合侵染病毒。

隨著現代植物病毒和類病毒檢測手段的發展，目前運用最為廣泛的是酶聯免疫法（ELISA），在國外已經形成商品化生產，但是每種病毒都需要特異的酶標記特異抗體，標記過程比較復雜，價格比較昂貴，有時也會產生非特異性的顏色干擾，而且不能鑒定不含外殼蛋白的類病毒。

北京市農林科學院于2008年申請的中國專利“一種用于檢測菊花B病毒的方法”（申請號：CN200810240415）和“一種用于檢測菊花褪綠斑駁類病毒的方法”（申請號：CN200810240414）公開了采用分子生物學方法檢測CVB和CChMVd的方法，但采用LAMP進行檢測容易受到污染，出現假陽性結果，對引物設計的要求非常高。

目前對于菊花在CVB和CChMVd復合侵染下可同時檢測出病原的技術未見報道，如果可同時檢測出病原，可提高檢測效率，顯著降低檢測成本。

發明內容

發明目的：本發明的目的是提供一種菊花CVB和CChMVd病毒的二重RT-PCR檢測方法，可同時檢測出CVB和CChMVd。

技術方案：為實現上述目的，本發明的一種菊花CVB和CChMVd病毒的二重RT-PCR檢測方法，包括如下步驟：

（1）從菊花植株取樣并提取總RNA；

（2）分別針對CVB和CChMVd病毒設計兩對特異性引物：CVB-F，CVB-R；CChMVd-F，CChMVd-R；

（3）以隨機六聚體為引物進行反轉錄得到兩種cDNA；?

（4）利用RT-PCR技術擴增所述cDNA，將擴增的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，得到665bp特異性片段表示感染CVB，得到206bp特異性片段表示感染CChMVd。

步驟（1）所述取樣包括菊花植株的花、上部葉片、下部葉片，取樣后將樣本用液氮冷凍保存。所述提取總RNA采用Takara公司提供的RNA提取試劑盒，得到的總RNA保存于-70℃超低溫冰箱。

步驟（2）所述兩對特異性引物分別為：

CVB-F：5’-ACCGAATTCTTAGTCACAATGCCTCCC-3’，

CVB-R：5’-TCCGAGCTCATAGAGACGGCATACCTT-3’；

CChMVd-F：5’-CAGTTTCGGCTTGTGCGGGAGT-3’，

CChMVd-R：5’-TCCGAGGAGAATATCCAACGAG-3’。

步驟（4）所述RT-PCR反應體系25μl中包括0.5μl?CVB-F，0.5μl?CVB-R，0.5μl?CChMVd-F，0.5μl?CChMVd-R。具體的說，所述RT-PCR反應在25μl的反應體系中還加入：1μl?dNTPs（2.5mmol/L），1μl?cDNA，2.5μl?10×PCR?Buffer，0.2μl?Taq酶，1.5μl?Mg²⁺。

步驟（4）所述RT-PCR反應設定為94℃預變性5?min，94℃變性45s，52℃退火45s，72℃延伸1min循環33次，72℃延伸10min。所述擴增的產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳，得到665bp的CVB特異性片段和206bp的CChMVd特異性片段。