[發明專利]一種抗金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫球蛋白F(ab’)2及其制備方法

有效

• 申請號: 201110202539.1
• 申請日: 2011-07-19
• 公開（公告）號: CN102286100A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 趙忠鵬;楊鵬輝;陳中偉;羅德炎;段越強;李敏;王希良
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C07K16/06;C07K14/31;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京太兆天元知識產權代理有限責任公司 11108
• 代理人: 張韜

1.一種抗SEB特異性免疫球蛋白F(ab′)₂，以重組SEB即rSEB或天然SEB即nSEB或重組SEB即rSEB和天然SEB即nSEB以等量混合為免疫原制備的，其特征在于：

所述重組SEB即rSEB免疫原是通過如下步驟制備得到：

(1)挑取pGEM-7Zf-SEB/DH5α單菌落于含50μg/ml的LB培養基中，36-38℃，培養11-13h后，以0.5％-2％接種量轉接新鮮培養基中，當OD600達到0.6～0.8時，30℃-35℃，1.0mM的IPTG誘導表達8h-11h，離心得菌體，純水洗1次，用0.1mM，pH7.0的Tris-HCl溶解，超聲波破碎，離心去菌體，取上清；

(2)將固體硫酸銨加入收集的上清液中，使其飽和度達43％-50％，3℃-6℃放置4-6h，11000-13000rpm離心8-12min，收集上清后繼續加入硫酸銨，使其飽和度達到70％-80％，3℃-6℃放置4-6h，11000-13000rpm離心8-12min，取沉淀；

(3)將經過70％-80％的硫酸銨沉淀的蛋白樣品溶解于1M硫酸銨溶液中，調蛋白濃度至150g/ml-200g/ml；將兩疏水柱Pheny?l?FF和Pheny?l?HP串聯后用1M的硫酸銨平衡，再將樣品以0.5ml/min-2ml/min的流速過此串聯疏水柱，收集穿透液；

(4)穿透液經緩沖液A(5mM?PB，pH7.2)3℃-6℃，11-13小時透析后，以3ml/min-8ml/min的流速上已平衡的SP即聚羥甲基丙烯酸酯陽離子柱，待紫外吸收值回到基線后，用緩沖液B(5mM?PB，0.5M?NaCl?pH7.4)進行線性梯度洗脫，收集蛋白峰；得純化后rSEB純品。

所述天然SEB即nSEB免疫原是通過如下步驟制備得到：

(1)挑取產B型腸毒素的金黃色葡萄球菌單菌落于Dolman培養液中，36-38℃培養11h-13h后，以0.5％-2％接種量均勻鋪于覆蓋滅菌玻璃紙的新鮮Dolman固體培養基平板表面，36℃-38℃孵育45h-50h，用無菌生理鹽水收獲刮洗菌苔，11000-13000rpm離心12-18min，取上清液用聚乙二醇8000濃縮25-35倍，置截留量4000-6000的透析袋中，在3℃-6℃條件下對pH5.8，8mM?PB充分透析平衡；?

(2)取平衡透析液至陽離子交換柱CM-32，依次以不同離子強度的PB：pH5.8，8mM、pH6.6，35mM和pH6.8，0.2M進行階段洗脫，流速控制為20ml/h-30ml/h，收集35mM洗脫峰，用pH5.8，2mM?PB充分透析平衡；

(3)取1/10-1/100凝膠過濾柱體積的粗純平衡液上樣至平衡過夜的凝膠過濾柱Sephadex?G-75即葡聚糖凝膠G-75，用pH5.8，2mM?PB洗脫，流速控制為5ml/h-10ml/h，收集第二個洗脫峰，對蒸餾水充分透析脫鹽，真空冷凍干燥，為純化的nSEB，3℃-6℃保存備用；

所述的抗SEB特異性免疫球蛋白F(ab′)₂，通過如下方法制備得到：

(1)nSEB或rSEB或nSEB和rSEB等量混合后加入不完全福氏佐劑乳化制備免疫原，采用皮下、肌肉、腹股溝淋巴結多點免疫經檢驗合格的動物，間隔18-23天，免疫四次，免疫劑量分別為2mg、4mg、8mg、16mg；當免疫動物ELISA效價達1∶64000-1∶128000時采集血漿，-78℃--70℃保存備用；

(2)向血漿中加入體積比1/10的S/D病毒滅活溶液滅活外源病毒，后加入0.070％-0.080％％硅藻土，攪拌后用濾板過濾，用無熱源2倍蒸餾水稀釋，后加入飽和度21％的硫酸銨混勻、離心棄沉淀纖維蛋白和白蛋白，上清再加入9％飽和度硫酸銨混勻離心沉淀IgG，用無熱源蒸餾水恢復原血漿體積，再用30％飽和度的硫酸銨混勻、離心得沉淀IgG，先加入原血漿體積的無熱源蒸餾水或加入無熱源0.9％氯化鈉溶液，后用6萬超濾器超濾、濃縮至原血漿體積的1/5-1/10，即為純化抗SEB?IgG；

(3)純化抗SEB?IgG用鹽酸調PH至3.0-3.5后，用胃蛋白酶切割，再用1M氫氧化鈉調PH至7.0-7.6，加熱55-60℃、25-35min，用帆布過濾，濾液為初步純化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗體；

(4)初步純化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗體過DEAE?Sepharose?Fast?Flow即二乙基氨基乙基瓊脂糖凝膠層析，柱平衡后，樣品液上柱，用由10mM?PB，1M?NaCl(pH7.0)配制的緩沖液洗脫，收集樣品峰，回流液直接上Q?Sepharose?Fast?Flow柱，完畢，用10mM?PB(pH7.4)洗柱至各基線平，用10mM?PB，1M?NaCl(pH7.4)緩沖液線性洗脫，收集樣品峰，再用6萬超濾器超濾除鹽、濃縮，用0.20μm-0.24μm除菌濾膜除菌，置2-8℃冷庫保存，得到純化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂原液。?