[發明專利]后期補加前體物利用短密青霉高效累積生產霉酚酸的方法

有效

• 申請號: 201110202202.0
• 申請日: 2011-07-19
• 公開（公告）號: CN102321697A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 孫愛友;魏東芝;董玉國;王麗華;徐瑞;張艦
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12P17/04
• 分類號: C12P17/04;C12R1/80
• 代理公司: 上?？剖⒅R產權代理有限公司 31225
• 代理人: 林君如

技術領域

本發明涉及一種生產霉酚酸的方法，尤其是涉及一種后期補加前體物利用短密青霉高效累積生產霉酚酸的方法。

背景技術

霉酚酸(myhophenoilc?acid，MPA)為短密青霉(Penicillium?brevicompactum)產生的抗真菌、抗腫瘤并具免疫抑制作用的抗生素。MPA是次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶的可逆性抑制劑，能選擇性地抑制淋巴細胞活性，它的2-乙基酯類衍生物——霉酚酸酯(MMF)是新一代免疫抑制劑，在臨床器官移植和自身免疫性疾病的治療方面展示了良好的應用前景。MPA做為合成MMF的前體化合物，提高MPA的工業化水平對于生產企業來說十分重要。

現代抗生素的大規模工業化生產絕大多數都由傳統的固體發酵改為液體深層發酵，霉酚酸的生產也是如此。在進行分批液體發酵培養時，人們逐漸發現次級代謝與霉菌生長相關聯的這種過程具有廣泛的研究戰略意義。這種情況常會出現在液體發酵時，研究表明次級代謝與生長營養后期有著重要的聯系。Brar(1968)在Clavicepspa?spali產生麥角堿的研究中發現了次級代謝的繁殖期模式只有在支持快速繁殖期的培養時才出現，如果培養傾向于限制生長時，次級代謝就是與生長相關聯。類似的情況還出現在Fusarium?sambucinum產生恩鐮抱菌素時，在青霉素發酵時也有類似的結果。在Aspergilluspa?rvulus進行napthalenine的搖瓶液體發酵時發現了次級代謝無論生長是否受限都表現為生長相關型。在短密青霉(Penicillium?brevicompactum)發酵時，發現霉酚酸的產量在貧瘩的或富集的培養基中均表現出與生長相關聯。

在液體發酵時，美國專利US?4452891提到，該菌在振蕩、27℃條件下培養6天能產生2.4g/L，而在非振蕩、27℃條件下培養14d能達到3.6g/L；而H.Ozali進行菌種誘變后，液體發酵水平由1.7g/L提高到5.8g/L。在營養缺陷型菌株提高產量上文獻報道0.5％的蛋氨酸會抑制40％霉酚酸的產量，篩選蛋氨酸缺陷的突變株可以將發酵水平提高50％；霉酚酸是一個典型的次級代謝產物，在微生物穩定期開始合成，整個發酵周期為8-13天。目前的文獻報道中均采用間歇發酵的方式，徐志南等研究采用將短密青霉的孢子固定在一個旋轉纖維床發酵罐(RFB)上分批發酵但是周期較長產量沒有得到顯著提高，而流加補料發酵方式幾乎沒有。因此在工業生產上采用流加補料發酵策略的方式有更廣泛的應用前景。在發酵過程中，短密青霉的菌絲生長分為球狀菌絲和絲狀菌絲，在，菌絲的生長與自溶并存，研究文獻表明絲狀菌絲更有利于霉酚酸的生產。因此發酵過程中如何累計更高的菌體密度，適當的添加霉酚酸合成前體物，并且不延長過長的霉酚酸發酵周期提高生產效率，控制好絲狀菌絲的生長與后期的菌絲自溶時機顯得尤為重要。合理的補加短密青霉累積霉酚酸的次級代謝途徑中的合成前體物能夠更好、更高效的提高霉酚酸產量和不延長發酵周期提高生產效率。

發明內容

本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種操作簡單、霉酚酸產量較高的后期補加前體物利用短密青霉高效累積生產霉酚酸的方法。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

后期補加前體物利用短密青霉高效累積生產霉酚酸的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

將短密青霉(Penicillium?brevicompactum)在PDA斜面基上培養10天，用30wt％甘油洗脫成為孢子懸濁液，按2wt％含量將孢子懸濁液接種到種子培養基上，控制溫度為28℃，活化培養72h，然后將活化后的短密青霉接種在發酵罐中，采用優化后的葡萄糖-甘氨酸液體培養基進行發酵培養，控制溫度為28℃，發酵得到霉酚酸。

所述的種子培養基為以下組分及含量：蛋白胨2.0g/L、酵母粉1.0g/L、淀粉1.0g/L、葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)10.0g/L，溶劑為蒸餾水，pH值為6.5。

所述的優化后的葡萄糖-甘氨酸液體培養基為以下組分及含量：葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)80～120g/L、甘氨酸12～15g/L、磷酸二氫鉀2～4g/L、硫酸鎂(MgSO₄·7H₂O)0.5～1g/L、甲硫氨酸0.5～1g/L，溶劑為蒸餾水，pH值為4.4～4.8。